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目的:内源性活性氧,以及化学诱变剂等外源性因素导致的DNA损伤负荷,激活机体DNA损伤应答基因,通过协调多层信号级联传导启动DNA损伤反应（DNA damage response,DDR）。核苷酸切除修复系统（nucleotide excision repair,NER）是DDR的关键组成部分,对于保护基因组完整性免受遗传毒性损害至关重要。以顺铂为代表的经典基因毒类药物诱导产生的DNA-加合物,主要由切除修复交叉互补基因1（excision repair cross complementing 1,ERCC1）编码蛋白为核心的NER系统负责修复,因此成为基因毒类化疗药物抗性产生的关键机制。ERCC1基因是NER通路最具特异性的限速酶基因,其基因多态性及表达水平一直作为铂类药物治疗肺癌的预测因子,然而研究结论不尽相同。可变剪接是转录组和蛋白质组多样性的重要来源,也为基因的功能研究提供了全新视角。研究发现可变剪接可作为肿瘤易感及预后的预测因子,同时许多环境致癌因子及化学治疗药物也可影响可变剪接;已经鉴定出许多破坏或操纵剪接体或剪接位点识别的化合物和寡核苷酸作为干预可变剪接的有效策略。近期研究表明靶向DNA损伤修复系统的关键因子,干扰DDR信号级联具有影响肿瘤微环境的生物学特性:DDR介导的细胞外信号可以增强肿瘤局部免疫反应,有利于改善患者预后。其中cGAS-STING作为胞质DNA传感器激活适应性免疫反应和先天性免疫反应通路,与DNA损伤疗法的临床相关性已成为研究的热点,因此,本研究首次探讨ERCC1基因的可变剪接对天然免疫通路cGAS-STING的影响。充分认识和深入探索ERCC1基因的可变剪接机制,并开发应用剪接疗法针对剪接过程的关键因子进行调控,挖掘抗肿瘤免疫激活的有效策略,有望为寻找有效的肺癌治疗靶点与预后生物标志提供重要的理论依据和科学线索。研究方法:1、肺癌病例结合体外顺铂抵抗细胞模型明确ERCC1基因不同剪接异构体与顺铂抗性的关联性:（1）术中收集肺癌组织使用MTT法对其进行药物敏感性试验,检测其顺铂IC50,并使用QPCR检测ERCC1基因外显子3和外显子8跳跃水平,分析其与顺铂抗性的关联;在A549及其顺铂抵抗细胞A549/DDP中验证上述肺癌病例研究结果。（2）在A549及A549/DDP中分别过表达或敲低不同剪接异构体,CCK8和γH2AX免疫荧光实验检测顺铂抗性的变化。（3）COIP实验明确ERCC1不同剪接异构体与NER系统关键因子XPA和XPF的结合能力,探索其作用机制。（4）通过Western blot检测cGAS、STING、IRF3、p IRF3,ELISA检测IFN-β蛋白水平,探索上述细胞cGAS-STING通路的活性。（5）过表达/敲低ERCC1不同剪接异构体,观测cGAS-STING通路活性的变化。2、探索ERCC1基因可变剪接的关键调控因子:（1）生物信息学网站筛查ERCC1基因可变剪接的关键调控因子,使用RIP实验验证A549及A549/DDP中候选剪接因子PRPF8与ERCC1基因pre-m RNA的结合情况。（2）使用si RNA靶向敲低PRPF8,检测ERCC1基因剪接异构体变化,明确其下游cGAS-STING通路相关蛋白的表达变化。（3）敲低顺铂抵抗细胞A549/DDP中PRPF8,CCK8和γH2AX免疫荧光实验评估其化疗增敏作用。（4）免疫组化检测肺癌组织中PRPF8蛋白表达水平,明确其与顺铂抗性(IC50)的关联。3、探索植物活性物质β-榄香烯对RNA结合蛋白PRPF8的影响,明确ERCC1基因可变剪接以及cGAS-STING通路的变化:（1）使用不同浓度β-榄香烯联合顺铂处理A549/DDP细胞,选择β-榄香烯适宜的处理剂量,结合γH2AX免疫荧光实验评估其对顺铂药物抵抗的增敏作用。（2）分析β-榄香烯处理对RNA结合蛋白PRPF8的影响及其靶基因ERCC1基因的剪接调控。（3）检测β-榄香烯处理对cGAS-STING通路活性的影响。结果:1、ERCC1基因外显子跳跃型可变剪接影响肺癌顺铂药物抵抗并改变cGAS-STING通路活性:（1）肺癌病例研究ERCC1基因外显子8包含水平及其与外显子8跳跃的比例与顺铂IC50显著正相关（P<0.05）,即外显子8包含水平越高,患者顺铂抗性越高;ERCC1基因外显子3跳跃水平与顺铂抗性呈负相关,其包含与跳跃的剪接异构体表达之比与之呈显著正相关（P<0.05）,即外显子3跳跃促进肺癌患者对顺铂的敏感性。顺铂处理A549及其顺铂抵抗细胞A549/DDP,证实其耐药株具有顺铂抗性,其耐药株中,ERCC1外显子3剪接指数显著高于敏感株,全长型ERCC1表达（外显子3和外显子8包含）显著高于敏感株。（2）在A549中分别过表达不同剪接异构体,其全长型ERCC1-FL促进顺铂抗性,IC50显著上调,DNA损伤水平显著降低,而外显子3跳跃ERCC1-E3D和外显子8跳跃ERCC1-E8D的剪接异构体过表达,未观测到顺铂抗性的显著变化;顺铂抵抗细胞A549/DDP中针对外显子3和外显子8敲低对应的剪接异构体,显著改善了该细胞的顺铂抗性,IC50显著降低,DNA损伤加剧,其中,外显子3的敲除,损伤较外显子8更显著,且IC50更低。（3）COIP实验证实外显子8缺失的剪接异构体丧失了与NER系统关键因子XPF的结合能力;外显子3的缺失对ERCC1与XPA的结合能力并无显著影响。（4）A549和A549/DDP细胞经过顺铂处理后,前者cGAS-STING通路显著激活,后者该通路活性下降。（5）在A549中分别过表达不同剪接异构体,其全长型ERCC1-FL显著抑制cGAS-STING通路活性,而外显子3跳跃ERCC1-E3D和外显子8跳跃ERCC1-E8D的剪接异构体过表达,未观测到该通路显著变化;顺铂抵抗细胞A549/DDP中针对外显子3和外显子8敲低对应的剪接异构体,该细胞中cGAS-STING通路被显著激活。2、RNA结合蛋白PRPF8调控ERCC1基因可变剪接促进顺铂抗性:（1）生物信息学分析证实PRPF8与ERCC1基因外显子8和外显子3表达呈正相关,RIP实验证实A549及其顺铂抵抗细胞A549/DDP中候选剪接因子PRPF8可与ERCC1基因pre-m RNA结合,调控其可变剪接。（2）使用si RNA靶向敲低PRPF8,ERCC1基因外显子3包含比例显著降低,下游cGAS-STING通路相关蛋白表达上调,呈显著激活状态。（3）敲低顺铂抵抗细胞A549/DDP中PRPF8,IC50显著降低,DNA损伤加剧,即显著改善了细胞的化疗抗性。（4）肺癌组织中PRPF8蛋白表达水平与顺铂抗性(IC50)呈正关联,且执行化疗治疗的患者,PRPF8高表达,预后不良。3、β-榄香烯下调剪接因子PRPF8改变ERCC1基因可变剪接调控cGAS-STING通路逆转肺癌顺铂抗性:（1）β-榄香烯联合顺铂处理A549/DDP细胞,IC50显著降低,DNA损伤加剧,即发挥顺铂增敏作用。（2）β-榄香烯下调RNA结合蛋白PRPF8改变靶基因ERCC1基因的剪接。（3）β-榄香烯处理挽救顺铂所致的cGAS-STING活性抑制,使得该通路重新激活。结论:1、本研究系统分析肺癌组织及细胞中ERCC1外显子跳跃型可变剪接与顺铂药物抵抗的关联,发现全长型ERCC1与XPA和XPF结合具有完善的DNA损伤修复功能,促进肺癌顺铂药物抵抗,同时抑制天然免疫通路cGAS-STING活性;靶向敲除外显子3和外显子对应的ERCC1剪接异构体,DNA损伤修复能力降低,改善肺癌顺铂药物抵抗,同时激活cGAS-STING通路。2、本研究结合生物信息学和实验研究鉴定了ERCC1基因可变剪接的关键调节因子,RNA结合蛋白PRPF8,通过与ERCC1 pre-m RNA的结合,该蛋白调控ERCC1基因外显子3的剪接,促进顺铂药物抵抗,导致患者预后不良;靶向敲低PRPF8,促进ERCC1外显子3跳跃,DNA损伤修复能力降低,改善肺癌顺铂药物抵抗,并激活cGAS-STING天然免疫通路。3、中草药提取物β-榄香烯与顺铂联合使用,通过下调剪接因子PRPF8的表达抑制靶基因ERCC1可变剪接,促使功能性的全长ERCC1表达显著下调,增加顺铂所致的遗传毒性,改善肺癌顺铂药物抵抗并重新激活cGAS-STING通路。