结肠癌是我国高发高危的常见恶性肿瘤之一,高居我国癌症致死率第三位。流行病学统计数据显示,全球范围内结直肠癌患者的数量逐年增加并呈加速趋势。尤其是近年来物质生活条件的改善,同时受到人口老龄化和环境问题等负面因素的影响,导致我国的结直肠癌发病率逐年升高,已经成为国内医学研究领域的关注重点。尽管随着各项研究的深入和技术的进步,结直肠癌的早期诊断和治疗手段都有了显著进步,包括内窥镜技术和放化疗药物的开发,但是肿瘤的诊断和治疗仍然面临诸多挑战。主要困境在于其发生发展机制仍未完全明确,临床的主要治疗方案是根治手术联合化学治疗,但是目前局部肿瘤5年的生存率仍不理想,同时超过50%的患者在确诊时已经出现不同程度和不同器官的转移,术后复发率极高,是导致结肠癌患者死亡的重要原因。由此可见,深入探索结肠癌的发生发展相关基因的调控表达机制,对于发展新的治疗策略和发现新的药物靶点具有极为重要的意义。miRNA是新近发现的一类长度为19-24个核苷酸的单链非编码小RNA,被发现具有广泛而重要的生理功能。目前研究已经证实,miRNA的作用主要是通过与靶基因的3’段结合,从而影响mRNA的转录翻译,进而对靶基因的表达进行特异性调控。值得注意的是miRNA的异常表达在肿瘤的发生发展中起到了极其重要的作用。针对其与癌细胞的功能关系研究发现,miRNA的表达能够参与调控细胞状态和功能维持、调节细胞增殖凋亡、迁移侵袭,从而对个体生长发育、维持机体功能等方面产生重要的调控作用。异常表达的miRNA是肿瘤发生发展中的关键调节因子之一,值得注意的是,不同miRNA在肿瘤发生中的作用及机制有其特异性。此外,miRNA在癌细胞中的上下游的调控机制往往更为复杂。为了明确miRNA在肿瘤发生发展中的作用和机制,在对miRNA的作用研究中,需要对其调控的基因网络和靶点蛋白进行关联性研究。miRNA-93作为最近被鉴定并证实的新miRNA,其在多种恶性肿瘤中起着重要的调控作用。在多种肿瘤中均证实了miRNA-93具有重要的调节作用。例如,有研究者报道,miR-93在结肠癌患者体内的表达出现异常升高,更有意义的是,miR-93表达水平与结肠癌各阶段状态及预后均存在明确相关性。此外,miR-93的异常升高与结肠癌的侵袭和转移状况有关,通过特异性抑制剂来下调miR-93的表达能够增加化疗药物对动物模型的敏感性。虽然目前研究能够表明miR-93与结肠癌的发生和预后密切相关,但是对于其调控机制尚不明确。抑癌基因PTEN,英文全称为phosphatase and tensin homolog that deleted on chromosome ten,是定位于染色体10q23.3的人磷酸酶及张力蛋白同源基因。PTEN在研究发现后,作为具有双特异磷酸酶活性的抑癌基因,迅速成为抗癌研究领域的热点靶蛋白。PTEN蛋白作为PTP(protein tyrosine phosphatases)蛋白家族的重要成员,是具有肿瘤抑制作用的核心蛋白之一,其主要作用是通过调控细胞分裂周期,抑制细胞增殖和促进细胞凋亡来实现。此外研究指出,PTEN蛋白在调控细胞转移、新血管生成等恶性肿瘤生物学行为方面具有重要作用。在临床上已经证实PTEN蛋白的表达水平具有作为肿瘤预后评价指标的潜在作用,由此可见进一步阐明PTEN及其调控的网络机制对肿瘤的诊断预后和药物靶点研究具有重要价值。为进一步探索miR-93在结肠癌中的作用地位和调控机制,首先收集并检测在临床结肠癌组织和癌旁正常组织中miR-93的表达改变,并在人结肠癌细胞系中进行验证。在此基础上,通过转染miR-93的抑制剂或过表达载体,对miR-93对结肠癌细胞多种生物学行为的作用进行明确;然后通过miRNA靶点基因预测软件对miR-93的下游靶基因进行预测并进行实验验证。综上所述,我们的研究结果将有望为结肠癌发生发展的机制提供新的思路和药物靶点,并为为结肠癌的早期诊断和临床治疗提供有价值的实验证据。1.材料与方法:临床样本收集来自2012年9月-2015年9月期间在吉林大学第一医院二部进行手术切除的临床样本结肠癌组织25例,同时收集癌旁正常组织23例作为实验对照组。通过Real-time PCR方法检测miR-93在结肠癌组织和癌旁组织、人结肠癌细胞株HCT116细胞和SW480细胞中的表达情况;采用原位杂交检测结肠癌组织中miR-93的表达情况。根据细胞株中的表达情况,采用人结肠癌细胞株HCT116细胞作为研究对象。采用LNA anti-miR-93 inhibitor转染HCT116细胞抑制miR-93的表达,同时设置空白对照组和阴性对照组,采用MTT法检测细胞活力的改变,采用细胞克隆实验检测细胞增殖能力,采用流式细胞术检测细胞凋亡状态。在明确miR-93在结肠癌细胞生物学行为中的作用后,采用miRNA靶点基因预测的生物信息学软件预测miR-93的可能的下游靶点可能为PTEN,然后通过双荧光素酶报告基因方法对上述预测结果进行进行实验验证。运用miR-93 mimics转染人结肠癌细胞株HCT116细胞增强miR-93的表达,运用LNA anti-miR-93 inhibitor转染HCT116细胞抑制miR-93的表达,在上述细胞模型的基础上,检测PI3K/Akt信号通路表达改变,从而对miR-93调控人结肠癌细胞的生物学行为的机制进行确认。2.结果:2.1 Real-time PCR的检测结果显示,miR-93在临床结肠癌组织样本及人结肠癌细胞系中的表达均出现显著上调。与正常结肠组织相比,miR-93的在肿瘤组织中的表达显著升高。以相应的癌旁组织作为对照,90.5%(22/25)的结肠癌组织中miR-93表达水平显著增加(p<0.01),结肠癌组的平均表达为2.09倍(与对照组相比);原位杂交实验进一步证实在结肠癌组织中发现miR-93表达增高。为进一步验证miR-93的表达异常,我们对人结肠癌细胞SW480和HCT116中miR-93表达水平进行检测,结果显示,SW480细胞中miR-93表达水平为正常组织的3.08倍(与癌旁组织相比,p<0.01);HCT116细胞中miR-93的表达水平为正常组织的3.79倍(与癌旁组织相比,p<0.01);由此可见在后续实验中,我们选择HCT116细胞株用于miR-93的功能和机制研究。2.2抑制miR-93的表达能够影响结肠癌细胞的活力和克隆增殖,促进结肠癌细胞凋亡。为了探索miR-93的异常高表达在结肠癌中的地位和作用,我们应用锁核酸反义miR-93转染来抑制HCT116细胞中的miR-93的表达。随后通过MTT实验检测细胞活力改变,结果表明,在转染24 h后,HCT116细胞活力出现显著下降为0.64±0.07,并随着转染时间的增加,细胞活力继续呈下降趋势,与空白对照组和阴性对照组相比(p<0.01),具有统计学差异。这表示miR-93的异常表达升高与结肠癌的发生密切相关。软琼脂的实验结果表明,结肠癌细胞内miR-93的表达被抑制后,细胞克隆的形成能力也受到了显著抑制。在上述miR-93表达下调的HCT116细胞模型的基础上,我们检测了miR-93表达下调对HCT116细胞凋亡的影响,流式细胞术检测结果显示,在转染24 h后,空白对照组(Blank)细胞的凋亡比例为8.7±1.5%,阴性对照组(LNA control)的细胞凋亡比例为12.6±1.9%,LNA anti-miR-93 inhibitor转染后对HCT116细胞凋亡显著增加至25.7±2.9%,与阴性对照组相比(p<0.01),具有统计学差异。2.3 PTEN是miR-93调控的下游靶蛋白。采用miRNA靶基因预测软件,我们筛选得到PTEN是miR-93的潜在靶蛋白之一。为验证miR-93对PTEN的调控作用,构建包含PTEN’UTR序列(野生型-PTEN)或删除miR-93结合位点(突变型-PTEN)的序列荧光素酶报告质粒,然后与miR-93拟似物共转染结肠癌细胞,检测发现结肠癌细胞内野生型PTEN的荧光素酶活性与对照miRNA转染的HCT116细胞相比,可见显著降低;但是转染突变型PTEN质粒的结肠癌HCT116细胞内荧光素酶活性与对照组相比未发现显著差异。为了进一步验证预测结果,我们采用western blot结合转染LNA anti-miR-93 inhibitor或者miR-93 mimics,检测结果证实,miR-93表达上调后,能够下调PTEN在结肠癌细胞HCT116中的表达,而miR-93表达下调后,PTEN在结肠癌细胞HCT116中的表达随之增强。2.4 miR-93调控PI3K/Akt信号通路。为了研究miR-93在结肠癌细胞HCT116中基因调控网络,我们检测了miR-93对关键信号通路PI3K-Akt的影响,我们通过转染LNA miR-93 inhibitor抑制结肠癌HCT116细胞内miR-93表达,随后对PI3K-Akt通路关键蛋白表达的mRNA水平进行实时定量PCR检测。miR-93表达下调后,PI3K,Akt和mTOR的mRNA水平均出现显著下降,其中PI3K mRNA下降为0.54±0.04(与对照组相比,p<0.01),Akt mRNA下降为0.51±0.05(与对照组相比,p<0.01),mTOR mRNA下降为0.72±0.06(与对照组相比,p<0.05)。为了进一步验证miR-93在结肠癌细胞HCT116中PI3K-Akt通路的影响,我们通过转染LNA miR-93 inhibitor抑制结肠癌HCT116细胞内miR-93表达,随后对PI3K-Akt通路关键蛋白表达的蛋白水平进行western blot检测。检测结果与mRNA检测结果一致,miR-93表达下调后,PI3K,Akt和mTOR的蛋白水平均出现显著下降,其中PI3K蛋白下降为0.49±0.05(与对照组相比,p<0.01),Akt蛋白下降为0.53±0.05(与对照组相比,p<0.01),mTOR蛋白下降为0.75±0.08(与对照组相比,p<0.05)。3.结论:3.1 miR-93在结肠癌组织及结肠癌细胞系中存在显著的高表达。3.2 miR-93表达受到抑制后,人结肠癌HCT116细胞活力下降,增殖能力受到明显抑制,同时结肠癌细胞的凋亡比例显著增加,这些结果暗示miR-93具有作为基因治疗的潜在价值。3.3生物信息学方法结合双荧光素酶方法,证实PTEN为miR-93调控的靶蛋白,PTEN的表达受到miR-93的抑制。3.4 miR-93表达抑制后,HCT116细胞中PI3K,Akt和mTOR的表达显著降低,我们的实验结果表明miR-93可能通过PI3K/Akt信号通路参与结肠癌发生发展的过程。