胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacilluspleuropneumoniae,APP）是引发猪胸膜肺炎的革兰氏阴性病原菌,给全球养猪业造成了重大经济损失。APP的18种血清型之间毒力各不相同,对其致病机理和影响致病性因素的研究有待深入。因此研究APP的毒力因子有利于对胸膜肺炎的综合防控。高温热激需求蛋白（high-temperature requirement A,HtrA）是一类高度保守的丝氨酸蛋白酶,在细菌周质中作为保护性免疫抗原和蛋白质的调控因子而发挥重要作用。在入侵宿主细胞的过程中,APP暴露于各种应激条件下,需要应激反应系统来应对这些不断变化的不利的外界环境。现已知在一些病原菌中,HtrA家族蛋白与细菌的生存及毒力密切相关。目前,人们对于APP应激适应的机制及其与细菌致病性的关系了解较少。本课题主要研究了 HtrA蛋白对于APP在应激条件下的存活及毒力的影响,取得的主要结果如下:1.构建htrA基因缺失突变株与回复突变株以APP血清1型菌株SLW01为亲本菌,通过同源重组、氯霉素介导的正选择和蔗糖介导的负向选择,筛选出对氯霉素敏感和抗蔗糖的突变株ΔhtrA;扩增完整的htrA基因,克隆到pJFF224-XN中,并通过电穿孔将穿梭质粒转化到ΔhtrA菌株中。通过氯霉素抗性筛选法,得到回复突变株ΔhtrA-Compl。2.分析htrA突变株的高温适应性将亲本菌SLW01、ΔhtrA和ΔhtrA-Compl接种于TSB中,分别在37℃及42℃下培养并绘制出生长曲线,结果显示在37℃下三种菌生长水平基本相同。在42℃时ΔhtrA较SLW01和ΔhtrA-Compl的生长明显受到抑制,在10 h内ΔhtrA的OD600均小于0.1,表明突变株在42℃时几乎无法生长,回复突变株ΔhtrA-Compl在42℃下的生长能力得到回复,其OD600值仅略低于SLW01（差异不显著）。由TSA平板计数结果可以看出,在42℃时ΔhtrA的活菌量较亲本菌SLW01和ΔhtrA-Compl显著减少。在高温应激状态下ΔhtrA缺失株的生长受到了非常明显的影响,ΔhtrA为高温（42℃）敏感型菌株,表明HtrA是APP高温应激适应必须蛋白。3.分析htrA突变株的氧化适应性亲本菌SLW01、ΔhtrA和ΔhtrA-Compl培养至对数生长期后转接于含2.5mM H202的TSB中,平板活菌计数计算三种菌的存活率。结果显示,ΔhtrA相比SLW01和ΔhtrA-Compl的存活率低,其氧化敏感性更高。ΔhtrA-Compl与SLW01存活率基本相同,说明回补htrA恢复了 ΔhtrA的氧化耐受性。结果表明,在氧化应激对ΔhtrA缺失株的生存抑制作用更为明显,证明HtrA对于APP在氧化应激条件下的存活较为重要。4.研究htrA突变株对小鼠致病力测定了 SLW01、ΔhtrA和ΔhtrA-Compl对小鼠的半数致死量、小鼠急性毒力和在小鼠肺组织载菌量,探究HtrA与APP的毒力相关性。接种相同剂量的三种菌后,相比SLW01和ΔhtrA-Compl,ΔhtrA感染组的小鼠死亡率更低,毒力明显减弱。接种ΔhtrA小鼠肺组织的细菌数量明显低于亲本菌SLW01和ΔhtrA-Compl。ΔhtrA和SLW01在小鼠肺部竞争感染指数远低于致弱临界值,表明htrA基因缺失能够影响APP的毒力,HtrA是APP的毒力因子。5.研究htrA突变株在猪血液和肺部定植的能力进一步通过猪感染试验,验证HtrA的致病性。通过鼻腔注射含相同菌量的ΔhtrA和SLW01混合菌液,分离肺组织和胸腔残血中的感染细菌,经PCR鉴定,计算两种菌在猪只的竞争感染指数。结果显示,在猪肺组织和残血中,突变株的竞争感染指数都低于致弱临界值,表明ΔhtrA突变株对猪的致病力下降,说明HtrA是APP的毒力决定因子。综上,本研究证实热应激需求蛋白HtrA是APP的重要毒力因子,HtrA的致病机理可能与其介导的细菌高温耐受和氧化应激耐受等免疫逃避过程相关。