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头颈癌是一类发生于咽喉部、口腔或鼻腔的恶性肿瘤,目前是世界上第六大恶性肿瘤,5年生存率约为50%,其中头颈部鳞状细胞癌(Head and neck squamous cell carcinoma,HNSCC)占全部头颈肿瘤发病率的85%～95%。90%以上的HNSCC患者死于肿瘤转移后的其他疾病而非原发性肿瘤破裂出血。肿瘤组织及细胞的持续生长、侵袭和迁移不仅依赖于原有细胞的基因突变,还依赖于肿瘤微环境的支持和调节。因此,我们需要探寻肿瘤微环境(Tumour microenvironment,TME)与癌症的关系,找寻癌症治疗的突破口,给患者以治疗的新希望。肿瘤微环境由内皮细胞、免疫细胞、肿瘤细胞等多种细胞组成,这些细胞在肿瘤微环境中具有复杂的相互作用。肿瘤相关巨噬细胞(Tumour-associated macrophages,TAMs)是一种重要的免疫细胞,它们在肿瘤微环境中的作用主要由M1(Classic activation of macrophage)或M2(Alternative activation of macrophage)表型特征决定。最近的研究表明,M2样TAMs(M2-like TAMs)能促进细胞基质分解、癌细胞迁移、血管生成和淋巴管生成,这些都是肿瘤转移所必需的。临床研究还表明,大量M2样TAMs的存在与预后不良呈正相关。因此,M2样TAMs可以作为一种新的肿瘤治疗靶点,而抑制M2巨噬细胞的极化则是一种行之有效的方法。双氢青蒿素(Dihydroartemisinin,DHA)是利用现代技术从青蒿中提取的半合成衍生物。已经证明它具有抗疟、抗病毒、抗炎和抗肿瘤的作用。然而,DHA能否通过调节肿瘤微环境中的TAMs来抑制NHSCC的进展和转移还未见报道。为了探讨DHA在肿瘤微环境中的作用,我们分三部分进行了实验。第一部分巨噬细胞M2型的诱导、鉴定及其对头颈鳞癌细胞的作用目的:本部分研究主旨是构建M2型巨噬细胞模型。同时通过体外诱导获得M2极化巨噬细胞,观察其对头颈鳞癌细胞的影响。并最终确定在头颈肿瘤TME中,M2巨噬细胞是否具有TAMs的作用。方法:1.为了获得M0巨噬细胞,需将悬浮的THP-1细胞中加入200ng/ml佛波酯(PMA)诱导24小时。将M0巨噬细胞再经20ng/ml的IL-4和IL-6诱导24小时后成为M2巨噬细胞。2.从形态学角度为观察、分析M0巨噬细胞和M2巨噬细胞的区别。3.运用流式细胞技术,检测M2巨噬细胞标志物CD163的表达量,以验证诱导是否成功。4.应用qRT-PCR技术,检测不同状态下巨噬细胞内m RNA的表达水平,同时进一步确认M0巨噬细胞被诱导成为M2极化巨噬细胞。5.将巨噬细胞不同状态下的培养基,在高速离心机上以4℃条件下,12000rpm/min,离心15 min,可获取巨噬细胞的条件培养基(CM)。6.在划痕实验和Transwell实验中,观察巨噬细胞在不同状态下所获得的条件培养基对头颈鳞癌细胞转移能力的影响。结果:1.M2细胞形态变化明显,细胞出现大量伪足,且形态以多边形或者梭形为主,贴壁更明显,呈抱团生长。2.经式细胞术检测结果和m RNA的结果显示:M2巨噬细胞标志物CD163的表达量较M0巨噬细胞有了明显升高。同时诱导后巨噬细胞的CD206、IL-10、MMP9和CCL18的m RNA水平明显上升,证明M2巨噬细胞诱导成功。3.经划痕实验和Transwell实验的验证,M2-CM较M0-CM和对照组培养基划痕间距更窄,transwell小室膜上细胞更多,以上结果表明M2巨噬细胞促进了头颈鳞癌细胞的转移。小结:1.经过PMA和IL-4/IL-6的联合诱导,可以将THP-1单核细胞诱导成为M2巨噬细胞。2.在头颈鳞癌微环境中,M2巨噬细胞具有与TAMs相似的作用。3.M2样TAMs可以促进头颈鳞癌细胞的迁移和侵袭。第二部分DHA对M2样TAMs的作用机制及其对头颈鳞癌细胞迁移、侵袭及血管生成影响目的:DHA对M2巨噬细胞的作用。观察加入DHA后M2巨噬细胞条件培养基(M2DHA-CM)对头颈鳞癌细胞的影响。研究DHA对M2巨噬细胞极化状态的作用机制。方法:1.应用MTT实验方法,检测DHA或DMSO对巨噬细胞的细胞毒性。2.从形态学特征分析,在DHA的作用前后,M2巨噬细胞的形态差异。3.应用ELISA检测DHA对M2巨噬细胞的作用效果及DMSO对M2巨噬细胞的作用效果。4.应用流式细胞技术检测和qRT-PCR检测,观察DHA作用前后,M2标志物CD163的表达水平及VEGFA、MMP10和MMP9的基因表达量的变化。5.应用划痕实验和Transwell实验,观察DHA作用前后M2巨噬细胞条件培养基对头颈鳞癌细胞迁移和侵袭能力的影响。6.应用成管实验,观察DHA处理前后M2条件培养基对头颈鳞癌血管生成能力的影响值。7.应用Western blot检测DHA作用下不同巨噬细胞激活状态下STAT3和P-STAT3的蛋白的表达水平。8.慢病毒介导后,应用Western blot和流式细胞技术检测DHA作用前后M2极化巨噬细胞CD163表达量和p-STAT3的表达水平变化。结果:1.根据MTT实验和ELISA实验的结果,巨噬细胞的存活率并不随DHA的浓度变化而出现明显改变。同时,DMSO对巨噬细胞存活率无影响,并根据之前本实验室贾立峰博士前期研究工作基础,选取DHA的浓度为50μM。2.对M2巨噬细胞的形态学观察发现,加入DHA后,细胞的伪足明显缩短或数量减少,且部分形态由多边形或者梭形变为卵圆形。3.根据ELISA的检测结果显示,DHA能降低M2-CM中的IL-10的表达水平,而DMSO的加入对培养基中IL-10的表达水平无影响。4.根据流式细胞检测的结果显示,DHA能降低M2型极化细胞的标志物CD163的表达水平。5.qRT-PCR检测结果显示,加入DHA后M2型极化细胞其内的VEGFA、MMP10和MMP9等基因的表达量均出现下降。6.划痕实验、transweill实验和成管实验结果表明,M2DHA-CM能提高头颈肿瘤细胞的划痕间距,减少transwell小室内膜上细胞数量及内皮细胞成环数量。7.Western blot和流式细胞检测的结果显示,p-STAT3蛋白表达量和M2数量正相关,DHA抑制了p-STAT3的表达,从而减少了M2极化巨噬细胞数量。小结:1.DHA改变了M2型细胞形态,减少了M2型巨噬细胞的数量。2.DHA抑制了M2样TAMs对头颈鳞癌细胞侵袭和迁移的促进作用。3.DHA抑制了M2样TAMs对头颈鳞癌的血管生成的促进作用。4.DHA通过阻止STAT3通路的磷酸化,来抑制巨噬细胞向M2端极化。第三部分DHA作用于M2样TAMs对头颈鳞癌增殖影响的在体研究目的:建立头颈鳞癌的动物模型,验证M2样TAMs促进肿瘤组织的血管生成和生长。以及DHA作用于M2样TAMs对头颈鳞癌肿瘤增殖的影响。方法:1.构建对照组和Fadu+M2组两组裸鼠模型,比较加入M2巨噬细胞后裸鼠肿瘤体积、肿瘤重量和裸鼠生存率之间的变化。2.应用免疫组化方法比较两组裸鼠中TAMs、肿瘤细胞和毛细血管的数量。3.比较加入DHA后,Fadu+M2组和DHA组的肿瘤体积、肿瘤重量和裸鼠生存率之间的变化。4.应用免疫组化方法和qRT-PCR的方法检测加入或不加入DHA的两组裸鼠中TAMs的数量变化,同时对比检测DHA作用下肿瘤微环境中VEGFA和MMP9的表达水平。结果:1.注射M2巨噬细胞的肿瘤裸鼠,其肿瘤体积、肿瘤重量和死亡率明显高于对照组,证明M2样TAMs具有促进肿瘤生长的作用。2.免疫组化显示,TAMs的数量和肿瘤细胞的增殖及毛细血管的增长呈正相关。3.DHA组中裸鼠的肿瘤体积、肿瘤重量较Fadu+M2组均有所下降,裸鼠生存率也得到了提高。4.免疫组化显示,经DHA治疗后,裸鼠移植瘤中的M2样TAMs的的数量明显下降,且Ki-67和CD31表达也出现下降。qRT-PCR结果显示组织中的MMP9和VEGFA的m RNA表达降低。小结:1.在头颈鳞癌移植瘤模型中,M2样TAMs促进头颈肿瘤的血管生成和生长。2.在头颈鳞癌移植瘤模型中,DHA减少了M2样TAMs的数量。3.在肿瘤微环境中,DHA抑制了头颈鳞癌的血管生成和生长。结论:经过我们的体内和体外实验我们得出如下结论:1.在头颈肿瘤体外实验中,TAMs更趋近于M2巨噬细胞。经过PMA和IL-4/IL-6的联合诱导,可以将THP-1单核细胞极化诱导成为M2巨噬细胞。2.M2样TAMs可以促进头颈鳞癌的生长、侵袭和迁移,以及肿瘤组织的血管生成。3.DHA通过阻止STAT3通路激活来抑制M2样TAMs的极化,减少M2样TAMs的数量。4.在动物移植瘤模型中,DHA减少了M2样TAMs的数量,同时抑制了头颈肿瘤的生长和肿瘤组织的毛细血管的生成。根据前期贾立峰博士和王唯一博士的实验,证明DHA对头颈鳞癌细胞有抑制增殖促进凋亡的作用。我的实验进一步补充说明DHA可以通过对肿瘤微环境中TAMs的调控,来抑制头颈鳞癌的发展和转移。