背景 通过双特异性抗体、免疫细胞因子、细胞因子融合蛋白等可以增加抗体、效应细胞对靶细胞的杀伤。目前，双功能分子因其在科研和临床中的巨大应用价值而越来越受到重视，重组DNA技术、人类基因组计划的完成使得许多疾病靶位的日渐明朗、对免疫系统机制的逐渐了解等等使双功能分子在许多疾病治疗中的应用前景十分可观。 T细胞识别、活化是免疫反应的核心问题，其活化需要抗原呈递细胞（Antigen-presenting cell，APC）提供的双重信号。已知许多肿瘤、病毒慢性感染等疾病，都与抗原提呈能力不足有关。白细胞介素-2（Interleukin-2，IL-2）、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（Granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF）等细胞因子是机体重要的生物调变分子，而且具有协同作用。本所设计具有通用性的双功能分子—重组人白细胞介素-2／粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（hIL-2／GM-CSF），设想能够通过其IL-2端结合T细胞，另一端结合抗原呈递细胞，如树突状细胞、单核／巨噬细胞等，这样，只要APC上具有相应的抗原特异性，就可能通过拉近、活化机制，提高抗原呈递能力，增强活化效率，诱导出特异性效应T细胞，增强细胞免疫水平。为了加快该双功能分子的功能研究，本研究在本所完成的hIL-2／GM-CSF在pLY4-hIL-2／GM-CSF／DH5α原核表达的基础之上，对hIL-2／GM-CSF表达体系进行改造，实现高密度发酵，提高产率和纯化效率，为该双功能分子生物学功能的基础研究提供良好的条件。布一军医大学协士学位论文双功能分子h1卜2/.冷‘SF原核表达及生物学功能初步研究目的 将hIL一2/GM一CSF基因重组于有较高效率的表达载体上，实现高效表达，在蛋白的末端人为加入6xhis纯化标记，有利于后期纯化工作，得到无热原、高纯度、较高比活的均质融合蛋白，为加快该双功能分子生物学功能的基础研究提供良好的条件。通过体外实验检测双功能分子对PBMC增殖作用以及树突状细胞抗原呈递能力及T细胞亚群的影响。我们将会继续深入研究T细胞识别活化作用机理，T细胞亚群的差异是否与双功能分子活化APC及T细胞产生的细胞因子种类、浓度有关，活化通路是否与常规通路不同等等，力图对T细胞识别、活化提供新见解。方法 从E.coli DH5a工程菌中提取携带hIL一2/GM一CSF基因的质粒，用PCR法克隆hIL一2/GM一CSF基因，并对融合基因测序结果进行生物信息学分析。根据分析结果和含升启动子的表达载体性质，在首尾分别引入酶切位点，构建三种不同表达载体，根据载体性质、宿主菌性质、诱导温度、正TG浓度选择优化表达条件，并进行高密度发酵，高压均质机破菌后，提取、洗涤包涵体，将打开二硫键的变性融合蛋白进行等容超滤复性后，阴离子层析和镍离子亲和层析结合纯化复性蛋白，采用阳离子柱层析、适当浓度TritonX一100流洗去除内毒素。利用SDS一AGE、westem Blotting、等电聚焦电泳、鳖试剂检测法、细胞因子比活测定等方法对hIL一2/GM一CSF质量进行评估。对hIL一2/GM一CSF功能进行初步研究，设置不同对照组检测双功能分子对人PBMC增殖能力的影响，并将体外诱导的髓系树突状细胞与自体PBL混合培养，改良MTT试剂测定混合淋巴细胞增殖情况，流式细胞仪检测其对T细胞亚群分化的影响。结果 获得的重组质粒经DNA测序，克隆的hIL一2/GM一csF其组成IL一2和GM一CSF基因序列与实验设计一致，为研究hIL一2/GM一CSF的表达奠定了基础。生物信息学分析显示改造前后融合蛋白hIL一2心M一csF疏水区和亲水区、二级结构、潜在的蛋白质抗原决定簇、特定区域位于蛋白质的表面的可能性、蛋白质骨架区的柔韧性等生物学基本特征没有明显 斗常一军医大学傅士学位论文双功能分子hI曰/。曰万F原核表达及生物学功能初步研究变化。 将重组质粒转化E.coli BLZI口E3)获得重组工程菌，筛选表达较好的体系并进行优化。结果重组质粒pET一1 Ic一hIL一2/GM一csF转化三种宿主菌后，在42℃和IPTG双重诱导下，均实现优化表达，表达量均比37℃诱导提高将近3倍，占菌体蛋白14.5%左右。 重组hIL一2/GM一CSF工程菌可以实现高密度发酵，20L发酵体积可以得到菌体湿重2，3709，目的蛋白占菌体蛋白的13.1%;粗制包涵体中蛋白含量为29.8%，包涵体经洗涤后，目的蛋白纯度达43.4%。 经过处理量大、给融合蛋白渐变温和复性条件的等容超滤法进行复性后，采用阴离子层析和镍离子亲和层析纯化，目的蛋白纯度理想，在还原状态下为98%，非还原状态下为%.5%;采用阳离子层析去除可能的热原，残留内毒素低于0.604E侧nil;一次投料509包涵体（约7g总蛋白），达到中试水平以上，最终得到纯品250mg;纯品经过免疫印迹和等电聚焦电泳检测，等电点为7.28的融合蛋白中单体分子具有良好的免疫原性和蛋白纯度;经细胞因子依赖株检测，融合蛋白中IL一2比活为SXlo6u加g，为天然IL一2比活的50%，oM一esF比活为IX一o7U/mg，达到生物制品要求。 初步研究结果表明，与IL一2、GM一CSF、IL一2+GM一esF对照组相比，双功能分