研究背景与目的胸腺是哺乳动物的中枢免疫器官,是T细胞分化发育和成熟的场所,胸腺为T细胞发育提供了一个缜密而复杂的微环境,有序的调控T细胞的发育成熟和迁移。胸腺基质细胞、可溶性分子以及细胞外基质共同构成T细胞发育的胸腺微环境。胸腺基质细胞间相互连接成网状结构,不仅起网状支架作用,而且由于这些细胞表面携带大量表面分子、并可以分泌多种胸腺激素和细胞因子,从而为胸腺细胞的发育和成熟提供合适的微环境。T细胞在胸腺内经历TCR重排,阳性选择和阴性选择等发育过程最终发育为成熟的T淋巴细胞并迁移到外周免疫器官。根据传统的诱导性中枢耐受的理论机制,如果T细胞发育过程中在胸腺内接触到异基因的抗原,则会被诱导出对该异基因外周移植物的耐受,同时,血-胸腺屏障使血液中的大分子物质包括外来抗原不能进入胸腺,所以胸腺内注射异基因抗原可以躲过免疫监视,诱导出对异基因抗原耐受的T细胞。为了探索异种抗原细胞在机体内的生物学特性及机体产生的免疫耐受和免疫排斥情况,我们将作为异种不同组织的、MHC差异较大的抗原人肝癌细胞Hep-G2注射到10-15d的C57BL/6小鼠的胸腺中,动态观察小鼠胸腺对其发生的应答,进而了解抗原在小鼠胸腺微环境中对T细胞发育的影响及胸腺内可能发生的免疫应答机制和外源人肝癌细胞对胸腺微环境及T细胞发育分化的影响,以及异种人肝癌细胞在小鼠胸腺内的命运。研究方法1.小鼠胸腺内注射及注射对小鼠胸腺造成的组织病理变化分析1)小鼠胸腺发育情况分析；2)细胞培养与DiI标记；3)胸腺内注射方法的简化；4)注射效率的评估：解剖学观察判断及FCM分析检测注射效率5)注射后小鼠体重变化分析与注射方法对小鼠的损伤评估；6)石蜡切片制作与HE染色观察；2.小鼠胸腺对异种抗原细胞的应答1)人肝癌细胞培养与DiI标记；2)小鼠胸腺内注射人肝癌细胞；3)小鼠胸腺组织称重及胸腺细胞绝对值计数；4)石蜡切片制作与HE染色观察胸腺组织病理变化；5)FCM分析胸腺内各类细胞亚群比例的变化(T细胞、NK/NKT细胞及调节性细胞)；6)FCM分析胸腺细胞凋亡情况；研究结果第一部分：小鼠胸腺发育情况分析小鼠在青春期前快速生长和发育,到青春期时达到一个顶峰,在此之后便开始萎缩；小鼠胸腺的体积也随年龄增长而变化。Dil染色标记观察Hep-G2人肝癌细胞在含有20ug/ml DiI的基本培养基中标记30min后,细胞标记成功,并发射出强烈的红色荧光。注射效率评估通过解剖学观察,成鼠组的注射成功率为81.47%,乳鼠组的注射成功率为76%,FCM分析的结果证实此种注射方法基本能够保证注射的准确性。注射方法对小鼠损伤程度的评估通过对注射后小鼠行为及体重的变化分析,我们发现实验组与对照组小鼠在体重和行为上均未表现出明显变化,由此我们认为此注射方法对小鼠的损伤程度很小,值得应用和推广。石蜡切片HE染色观察结果Hep-G2在小鼠胸腺内遭遇到淋巴细胞的攻击与杀伤,注射后3d就检测到淋巴细胞的浸润及巨噬细胞的募集；注射后7d,大部分的肿瘤细胞已经死亡,肿瘤细胞周围密集大量的淋巴细胞；注射后14d,已经检测不到存活的肿瘤细胞,肿瘤细胞形态模糊,周围大量淋巴细胞密集；注射后21d和28d,已经检测不到肿瘤细胞的存在。第二部分：胸腺重量及胸腺细胞总数变化相比于平行对照组,胸腺内注射人肝癌细胞后7d,14d及21d实验组小鼠的胸腺重量明显增加,而此时的胸腺细胞总数却明显减少。小鼠胸腺组织有一定损伤注射后3d检测到注入人肝癌细胞的胸腺组织区域有机械损伤的迹象,有的能明显看出是注射针在胸腺内入针时造成的机械损伤,有些则为细胞悬液及注射针推力共同作用的结果。小鼠胸腺组织皮质与髓质比例变化胸腺内注射人肝癌细胞后3d,检测到胸腺内肿瘤细胞密集的区域为大面积的髓质区,而注射后14d的结果显示髓质区明显增加,而皮质区却很少。胸腺上皮细胞变化小鼠胸腺内注射人肝癌细胞后,梭形上皮细胞聚集并环绕在肿瘤细胞周围,注射后16d上皮细胞非常密集并环绕肿瘤细胞残骸形成椭圆形结构,注射后21d和28d数层鳞状上皮细胞环绕围成同心圆结构包绕肿瘤细胞残骸,注射后2个月胸腺组织恢复正常。胸腺内注射后,在小鼠胸腺组织空隙的地方检测到上皮细胞的富集,提示上皮细胞参与了胸腺组织的重建过程。FCM检测胸腺内各类细胞亚群变化与对照组小鼠相比,注射Hep-G2后1周的小鼠胸腺内CD4CD8双阳性细胞比例明显减少,CD4CD8双阴性细胞、CD4/CD8单阳性细胞及NKT细胞的比例有明显升高现象；注射后2周检测到调节性T细胞的比例也有增高的现象；注射后3周胸腺内T淋巴细胞、NK/NKT细胞的比例未见有明显变化；胸腺细胞凋亡检测胸腺内注射Hep-G2后1周,实验组小鼠胸腺细胞的凋亡率有明显升高现象,注射后3周凋亡率没有明显变化。研究结论1.通过对小鼠胸腺内注射方法进行简化,我们构建了一种简单的小鼠胸腺内注射的方法用于动物实验的研究。2.明确了异种人肝癌细胞Hep-G2在小鼠胸腺内被免疫细胞攻击与清除的命运,并初步确定巨噬细胞、NK细胞及成熟的T淋巴细胞均参与了Hep-G2细胞的免疫攻击与清除。3. Hep-G2的注入,对小鼠胸腺组织造成一定的病理损伤,包括注射造成的胸腺组织机械损伤、皮质与髓质比例的失衡、胸腺细胞总数的减少及上皮细胞的严重增生等,但随着外来肿瘤细胞的免疫清除,这些组织病理学变化也逐渐消失,小鼠胸腺组织恢复正常。4.人肝癌细胞的人为注入,对小鼠胸腺内T细胞发育及各类细胞亚群比例均造成一定影响,胸腺细胞凋亡比例升高,CD4CD8双阳性细胞比例显著减小,同时,CD4/CD8单阳性细胞、调节性T细胞及NK/NKT细胞的比例有所上升,但随着外来肿瘤细胞的免疫清除,各类细胞亚群比例又恢复正常。