香草醛作为世界第三大食用香料,广泛应用于食品、医药、化妆品、烟草等领域。天然香草醛可从香草豆荚中提取得到,但产量少,且价格昂贵。通过微生物或酶法转化获得的香草醛属于天然香草醛,并且生产成本低,是最具有发展前景的替代方法之一。异丁香酚单加氧酶（IEM）是催化前体物质异丁香酚转化为香草醛的唯一关键酶,但现有的异丁香酚单加氧酶由于受到产物抑制而导致酶活不高,因此采用生物催化法催化转化生产香草醛的难题主要是如何高效制备异丁香酚单加氧酶。目前定向进化对酶进行改造是有效提高酶活的方法,但定向进化需要合适的高通量筛选方法以及合理的突变文库,研究通过对高通量筛选的初筛法（TBA）以及复筛法（HPLC）进行系统的优化,得到一个较合理的筛选方法,在此基础上建立IEM的随机突变文库并筛选得到酶活提高23%的突变菌V50D。同时通过半理性设计对IEM进行定点突变改造,得到酶活提高35%的突变菌T52P。此外,初步对新型固定化材料Ca-alginate/PAAm固定E.coli BL21（DE3）pET21a-IEM细胞的方法进行探究,主要研究内容如下:本研究基于96深孔板的硫代巴比妥酸（TBA）法,探究TBA的检测限、TBA法与香草醛浓度的关系以及无水乙醇对TBA法的影响、底物异丁香酚对TBA检测香草醛的干扰程度等方面进行探究,引入无水乙醇改善检测体系,优化后的TBA法测检测体系为66.7%盐酸溶液为:1%硫代巴比妥酸溶液:无水乙醇:待测样品=100μL:40μL:100μL:10μL。优化后的检测体系标准偏差为4.1%,符合高通量筛选要求。其次高通量筛选时底物异丁香酚加入量为10-4-10-5 mol/L时会对TBA法的检测干扰程度小,过高的浓度容易生成沉淀。此外优化得到HPLC复筛法的最优检测条件为梯度洗脱程序2（0 min:100%甲醇/0.1%冰醋酸=35/65;7 min:100%甲醇/0.1%冰醋酸=80/20;13 min:100%甲醇/0.1%冰醋酸=35/65）。研究采用cepPCR与Megawhop PCR相结合的方法构建得到异丁香酚单加氧酶基因突变体文库,使用cepPCR将IEM基因序列划分为大小为500 bp左右的三个片段,分别进行随机突变,随后根据Megawhop PCR构建得到一系列突变菌株。cepPCR突变体系中加入0.5 M的锰离子为宜,以此浓度造成的随机突变位点约为1-3个,符合高通量筛选的文库要求。通过筛选,本部分得到8个相对转化能力与原始菌株IEM差异较大的突变菌株,测序得到该8株菌株分别为F41D、V50D、F98T、V159G/D312H、G186G、K242、A348Q、D361P。其中正向突变菌株为V50D、F98T、G186G、K242E,分别相对IEM活性增加23%、13%、9%、15%。综合使用基于序列保守性分析和基于结构吉布斯自由能变分析的方法,设计24个突变位点,成功克隆出相应的IEM-Mutant,对突变菌株进行酶活检测并与原始IEM菌株比对,结果表明约有50%的突变体的活性高于IEM,其中IEM-T52P突变体的活性最高,在上述转化体系下,当使用突变体IEM-T52P催化时得到的香草醛浓度为0.63 g/L,相对于IEM（约0.46 g/L）提高了35%,另外突变体IEM-W279F/F281Q,IEM-S122N,IEM-F216N均有小幅度的活性改善,香草醛产率分别增加到0.5 g/L,0.54 g/L,0.51 g/L。研究结果也表明其他突变体有不同程度的降低活性的副作用。采用Ca-alginate/PAAm结合三价铝离子对细胞进行了初步的固定化条件的摸索,分别对细胞浸泡浓度、细胞浸泡时间、甘油浸泡时长、铝离子交联浓度和交联时间五个固定化步骤进行了优化,初步得到最佳固定化细胞条件为:200 rpm条件下将凝胶置于32g/L的细胞中浸泡10 h,pH 10.5甘氨酸-氢氧化钠缓冲液洗去表面多余细胞后,于100%甘油中浸泡1 h,采用0.01 M的AlCl3溶液交联90 min,再使用甘氨酸-氢氧化钠溶液清洗除去凝胶表面多余的AlCl3溶液得到固定化细胞。