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目前,生命科学的探索缺乏系统理论的指导。肿瘤是生命体系中典型代表之一。本研究拟利用物理化学开放式系统理论来指导肿瘤的治疗研究。肿瘤细胞来源于正常细胞,和正常细胞主要区别在于其不受周边组织限制的增长,自成结构,形成一个不受制约的有着输入和输出的开放式系统。一个快速膨胀的开放式系统来不及自我修复和完善,意味着其系统内积聚的损伤不同于正常的生命系统那样容易修复;且在一个系统里,当损伤积聚至临界点时,一个微小的扰动都能导致系统崩溃。基于此点,本文利用物理手段--极低频电磁场ELF—EMF在肿瘤细胞内特异性的积聚这种微小损伤,而正常细胞系统往往能及时修复这种微小损伤而不会积累这种微小损伤,从而达到特异性杀伤肿瘤细胞而对正常细胞伤害较小的目的。目前,丧失手术治疗机会后的晚期肝癌尚无有效的治疗手段。因此本文将肝癌细胞和肝细胞作为研究该治疗手段的模型。
由于低频电磁场单独应用其致细胞凋亡作用过于缓慢,因此探讨联合一种基础性损伤手段--亚致死剂量的x线照射,在该亚致死剂量x线损伤的基础上,通过多次ELF—EMF照射,在肿瘤细胞内反复积聚损伤至临界点时,诱导系统崩溃即细胞凋亡,而正常细胞在ELF-EMF照射间歇内能修复损伤,从而避免损伤的积累。以往对于ELF-EMF的细胞效应机制多局限于其对DNA损伤的研究,没有研究其影响细胞系统的分子网络机制及从系统的高度来阐述其生物效应机制。本研究在基因水平上对其生物效应机制进行分子网络机制的探讨。另外,也探讨一种能与ELF-EMF产生协同抗肿瘤作用的方法,磁性纳米粒子在高频电磁场下的振荡导致细胞内机械损伤可诱导细胞的凋亡,因此它和低频电磁场联用亦能达到增强诱导肝癌细胞凋亡的效果。
本文通过制备磁性纳米粒子、建立ELF—EMF发生装置,利用X线医疗仪器直线加速器以及细胞分子生物学手段,探讨ELF-EMF辐射联用X线辐射和磁性纳米粒子标记这两种手段对肝癌细胞和正常肝细胞的不同的生物效应。观察这种生物效应在肝癌动物模型试验中的应用。并通过基因芯片方法,进一步探讨ELF—EMF特异性影响肝癌细胞的分子网络机制。为判断基因芯片结果的可靠性,选取基因芯片筛选到相关候选基因,观察其他方法鉴定的这些基因表达情况是否与基因芯片结果一致。
结果显示,ELF—EMF联合磁性纳米粒子标记方法能产生协同诱导凋亡效果,而且纳米粒径越小,这种协同诱导细胞凋亡和死亡的效果越明显。在ELF—EMF联用亚致死剂量X线时,ELF—EMF的细胞凋亡效果最为明显,而联用高致死剂量X线时,并不能显著增强凋亡率;而且,EMF和亚致死剂量x线或磁性纳米粒子的联合手段在肝癌细胞中诱导的凋亡率要显著高于肝细胞L—02。同样,ELF—EMF联合亚致死剂量x线(而不是高剂量x线)的选择性杀灭肿瘤细胞的效果在动物试验中也被观察到,该联合治疗组的肝癌动物生存期是最长的。在ELF—EMF影响肝癌细胞的分子网络机制中,发现ELF-EMF在肝癌细胞中主要通过促进细胞周期转移,使来不及修复的DNA损伤带入下代细胞,从而不断积累DNA损伤,表现为DNA修复基因表达数量的增加;且ELF—EMF可导致肝癌细胞线粒体凋亡途径中细胞色素c释放量及促细胞色素c释放基因表达上升,从而促进凋亡。而在ELF—EMF影响肝细胞L—02的分子信号通路中,以上基因的表现正好相反,因此从分子网络机制信号通路上说明了为何ELF-EMF联用亚致死剂量X线和纳米粒子时能促进细胞凋亡,且为何其诱导凋亡效果在肝癌细胞中明显强于正常肝细胞。
在对基因芯片筛选出来的相关凋亡抑制基因选取个别基因如SODD、SURVIVIN、GGT II进行鉴定,证实这些基因在基因芯片中的表达情况与病理组织、病人血清中一致,与免疫组化、RT—PCR和ELISA方法的结果一致,说明了基因芯片的结果可靠性。其中GGT II蛋白的表达在肝癌细胞中被ELF—EMF抑制,与基因表达芯片中该基因mRNA表达被ELF—EMF下调的结果一致。说明以上分子机制假说之基因芯片数据的可靠性。
本研究首次探讨了低频EMF联用低剂量x线以及磁性纳米粒子标记对肝癌细胞所产生的协同作用。并在动物实验中证实了EMF联用低剂量x线对延长动物生存和缩小肿瘤的协同作用。证实了ELF—EMF对癌细胞和正常细胞有着不同的细胞效应。说明EMF联用纳米粒子标记或低剂量x线是一种有潜力的抗肝癌新方法。
本研究首次探讨了ELF—EMF对肝癌细胞和肝细胞的生物效应的分子网络机制;并选取相关基因进行鉴定,证实了基因芯片结果的可靠性。我们因此得出ELF—EMF影响肝癌细胞的假说:ELF—EMF对肝癌细胞的信号通路的影响不同于正常肝细胞,在肝癌细胞中ELF—EMF可促使细胞周期的转换,将其诱导的DNA损伤带入下一代细胞,并不断积累DNA损伤,与此同时,ELF—EMF上调肝癌细胞的色素c释放基因,促进细胞凋亡;而正常细胞中ELF—EMF不能促进细胞周期的转换,相关促周期转换基因被抑制,因此DNA损伤不易带入下一代细胞而得到及时修复,而同时细胞色素c释放基因也被抑制,从而抑制凋亡,故ELF-EMF对正常细胞协同诱导凋亡效应不如肝癌细胞明显。因此从分子网络机制上验证了以上非线性系统理论的假说,即快速膨胀的系统其自稳和自我修复功能不如正常的具有自我约束力的系统,从而使得ELF-EMF能在肝癌细胞内积累损伤并最终诱导其凋亡,而避免对正常肝细胞组织中的损伤。