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肝纤维化(fibrosis of liver)是由各种慢性肝病发展到肝硬化、肝癌的中间必经阶段,主要表现为细胞外基质(extracelluar matrix,ECM)在肝内的大量沉积,并由此导致肝脏功能损伤。其中胶原是ECM的主要来源是,抑制胶原的合成能够减慢肝纤维化的发生和发展。TGF-β1是公认的调控肝纤维化形成的因子,在肝纤维化疾病过程中,TGF-β1激活HSC,促使ECM产生,同时会抑制基质金属蛋白酶,使胶原降解减少,逐渐加重肝纤维化。Smad2和Smad3作为TGF-β信号下传的主要效应分子,结构上相似,但功能呈多样化。在肝纤维化中,Smad3是致病性的,而Smad2所扮演的具体角色还不确定。本研究采用皮下注射50%CCl4植物油溶液(1ml/kg)12周建立大鼠肝纤维化模型,TGF-β1刺激人肝星状细胞株LX-2为细胞模型,采用激光共聚焦、分子生物学、明胶酶谱等手段检测肝纤维化病程中Smad2和Smad3的表达变化。(1)Smad2和Smad3在肝星状细胞中表达采用CCl4皮下注射SD大鼠12周,复制模型。HE和Masson染色结果显示模型组大鼠肝组织出现肝纤维化的病理变化;Western blot和PCR检测Col.I的表达发现Col.I在模型组明显升高,表明大鼠肝纤维化进展期模型建立完成。同时免疫荧光对α-SMA和p-Smad2,α-SMA和p-Smad3进行双染,显示p-Smad2和p-Smad3在肝星状细胞有表达,Western blot检测p-Smad2和p-Smad3在进展期表达均升高。(2)采用小干扰RNA技术沉默Smad2和Smad3。细胞株中沉默Smad2基因后,Col.I表达明显上升与正常组相比,基质金属蛋白酶MMP-2及其抑制剂TIMP-1的平衡被打破,MMP-2降低,TIMP-1升高,提示Smad2沉默后基质的生成增多,降解减少。而Smad3基因沉默后Col.I生成减少;(3)过表达Smad2后Col.I和TIMP-1表达降低,但MMP-2升高,提示Smad2过表达后基质的生成减少,降解增多。Smad3基因过表达后结果相反;(4)Smad2抑制了Smad3的磷酸化及核转位,这可能是Smad2抑制Smad3介导的的纤维化的机制所在。采用免疫荧光检测Smad2沉默后P-Smad3的核转位情况。沉默Smad2后PSmad3的核转位增加。Western blot检测沉默Smad2后P-Smad3的表达增加,过表达Smad2后P-Smad3的表达降低。综上所述,Smad2会成为探究肝纤维化治疗方法中的新靶点。