结核病（TB）主要由结核分枝杆菌引起,是一种严重的传染病,对全球公共卫生产生破坏性影响。唯一使用的卡介苗疫苗可以在儿童时期预防严重结核病,但随着年龄的增长,保护效果减弱,对成人的结核病保护有限。传统的结核亚单位疫苗主要诱导细胞免疫。然而近年来,研究人员开始关注反向疫苗学、粘膜免疫和抗体介导的保护性免疫。因此,迫切需要开发一种新的安全有效的结核亚单位疫苗,作为传统疫苗的补充。反向疫苗学是确定候选疫苗策略的一个重大进展。对由反向疫苗学发现的疫苗抗原的评价为探索传统技术无法识别的蛋白质的保护能力提供了可能。本研究中高免疫原性、抗原性和分泌性纤维连接素结合蛋白（Fbps）被用于新型结核病候选亚单位疫苗的开发,Fbps对维持分枝杆菌细胞包膜Ag85B抗原的完整性至关重要。通过鼻内接种分析了新型亚单位疫苗的免疫学特性。论文可分为两部分。在第一部分中,我们应用先进的计算技术开发了一种新型的抗结核多表位亚基疫苗。第二部分构建了用不同佐剂乳化的单蛋白突变体Ag85B（m Ag85B）,诱导对结核的黏膜免疫。主要结果如下:1.利用反向疫苗学对基于表位的抗结核候选疫苗进行硅质分析我们通过先进的计算技术、应用反向疫苗学方法设计了一种非常保守的、经实验证实包括Rv2608、Rv2684Rv、Rv3804c（Ag85A）和Rv0125（Mtb32A）的结核分枝杆菌抗原的多表位（B细胞和T细胞）亚基疫苗。这些表位是通过连接者相互联系起来的。使用不同的服务器来预测蛋白质的各种物理化学性质、蛋白质溶解度和次级结构。运用生物信息学工具预测、改进和验证三D结构,然后与toll样受体（TLR-3）对接,并进行硅克隆、密码子优化和免疫刺激。选择4个B细胞表位、4个HTL表位和10个CTL表位,设计了一种符合结合亲和力、抗原性、抗毒性、抗过敏性标准的新型疫苗。在不同服务器上疫苗序列被评估是抗原的和非过敏性的。最终蛋白的分子量估计为31.9k Da,不稳定性指数值为25.51,表明该蛋白非常稳定,该蛋白在表达时具有高度可溶性。疫苗具有（20.0%）α-螺旋、（21.0%）β-链和（58.0%）线圈的二级结构预测。密码子优化指数（CAI）值为1.0,平均GC含量为59.2%,表明该基因在大肠杆菌（E.coli）宿主中具有高表达。免疫模拟结果显示免疫细胞有明显的反应。这项研究也为设计一种基于肽的结核病疫苗提供了良好的标志。我们的发现表明,这个多表位疫苗可能激活体液和细胞免疫反应,可能是结核病疫苗的候选者。因此,需要更多的实验验证。2.C57BL/6小鼠模型中突变体Ag85B的构建及鼻内免疫应答评价在Ag85B中引入点突变,使Ag85B蛋白处于可溶性状态。构建了原核表达质粒p ET30a-m Ag85B,用异丙基-β-D硫代半乳糖吡喃苷（IPTG）诱导表达并通过透析法纯化。以氢氧化铝/聚肌苷-聚胞苷酸[poly（I:C）]（AP）和N,N’-二甲基-N,N’-十八烷基溴化铵（DDA）/poly（I:C）（DP）为佐剂,对m Ag85B进行乳化。C57BL/6小鼠鼻内免疫3次,间隔2周,用BCG和PBS免疫小鼠作为对照。末次免疫后5周,ELISA检测血清特异性Ig G、Ig G1、Ig G2c水平及分泌性Ig A（s Ig A）抗体水平。用特异性抗原m Ag85B和分枝杆菌体外刺激脾淋巴细胞分泌IFN-γ水平。结核病纯化蛋白衍生物（PPD）。分析了不同复合佐剂的亚单位疫苗的免疫学特性。对突变型分枝杆菌抗原85B在小鼠体内的免疫应答进行了克隆、表达、纯化和评价,在大肠杆菌BL21中高表达m Ag85B蛋白,经透析法纯化。m Ag85B通过诱导高水平的细胞因子干扰素-γ（IFN-γ）,强大的抗体免疫球蛋白G（Ig G）亚型,即Ig G1,Ig G2a,Ig G2b和分泌Ig A（s Ig A）反应,显示出很高的免疫刺激特性。在m Ag85B或PPD刺激下,m Ag85B的免疫原性、m Ag85B免疫小鼠的IFN-γ、Ig G亚型和s Ig A水平均高于卡介苗或PBS对照（P<0.05）。用氢氧化铝、聚I:C（AP）、DP等佐剂对m Ag85B蛋白进行鼻内接种,可诱导抗原特异性细胞免疫。因此,可以有效地应用于结核病疫苗的研究。