【摘 要】
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木薯（Manihot elculenta Crantz）为大戟科木薯属植物,是非洲、拉丁美洲等热带和亚热带地区重要的粮食作物,也是淀粉工业和生物质能源的重要原料。木薯块根淀粉含量占块根干重的70%以上,但块根淀粉如何高效积累?信号转导相关蛋白质对块根淀粉积累起到什么作用?对这些关键科学问题尚未清楚。为解析木薯块根淀粉高效积累分子机理,培育高淀粉木薯新品种,本研究利用iTRAQ技术研究高淀粉木薯品种
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木薯（Manihot elculenta Crantz）为大戟科木薯属植物,是非洲、拉丁美洲等热带和亚热带地区重要的粮食作物,也是淀粉工业和生物质能源的重要原料。木薯块根淀粉含量占块根干重的70%以上,但块根淀粉如何高效积累?信号转导相关蛋白质对块根淀粉积累起到什么作用?对这些关键科学问题尚未清楚。为解析木薯块根淀粉高效积累分子机理,培育高淀粉木薯新品种,本研究利用iTRAQ技术研究高淀粉木薯品种SC9、淀粉含量中等品种SC14和粉红木薯BRA117315、低淀粉含量品种糖木薯CAS36-12块根全蛋白质的变化,重点分析这4种木薯块根在碳与能量代谢通路中的差异蛋白质,构建与块根淀粉积累密切相关的差异蛋白质互作调控网络,阐述木薯块根淀粉高效积累的蛋白质互作模式。从差异蛋白质互作调控网络中挑选出关键调节因子木薯14-3-3蛋白质进行研究,分离鉴定出16个木薯Me14-3-3基因,分析木薯Me14-3-3基因家族的组织特异性表达,对Me14-3-3蛋白质进行亚细胞定位,确定木薯Me14-3-3基因表达与块根淀粉积累的关联性。开展敲除和过量表达Me14-3-3基因工作,为发掘Me14-3-3蛋白质在木薯淀粉积累中的作用机理打下坚实的基础。主要研究结果如下:1、本研究得到二级谱图总数280,338张,匹配谱图数量46,105张,匹配特有肽段谱图数量33,779张;鉴定到肽段数量14,676,其中特有肽段序列数量11,925;鉴定蛋白质数量为3,825个。以KEGG数据库为参考,将105条代谢途径,1081个差异蛋白进行功能注释,分为10大类,其中碳代谢和能量代谢包含24条代谢通路,366个差异蛋白质。2、利用在线String软件构建碳代谢和能量代谢中差异蛋白质的生物调控互作网络,找到连线条数较多的蛋白质,其中主要是催化蛋白质和结合蛋白质。其中木薯Me14-3-3蛋白质家族多个成员在淀粉含量不同品种之间显著差异表达,作为与磷酸丝氨酸/苏氨酸结合的第一信号分子,它直接参与调节蛋白激酶和蛋白磷酸化酶的活性,在细胞的信号转导中起着至关重要的作用。木薯Me14-3-3蛋白质家族参与碳代谢和能量代谢,很可能是木薯块根淀粉合成中的关键调节因子。3、对木薯Me14-3-3蛋白质家族进行基因克隆,共分离鉴定出16个木薯Me14-3-3基因。采用生物信息学方法对16个木薯Me14-3-3基因序列进行分析和预测,结果表明16个木薯Me14-3-3基因成员中,除Me14-3-3II基因外,其它基因编码的氨基酸残基数目在250左右;分子质量均在14.7～30.05 KDa之间;理论等电点在4.57～4.98之间;大部分为不稳定蛋白;是二级结构相似的亲水性蛋白;大部分蛋白有九个保守的结构域;进化关系可分为两支ε类和non-ε类,ε类的基因结构为6个外显子,non-ε类的基因结构为4个外显子。4、木薯Me14-3-3基因组织特异性分析结果表明:Me14-3-3XII和Me14-3-3XIII在须根和根顶端分生组织中表达相对较高;Me14-3-3VI,Me14-3-3VII和Me14-3-3VIII在细胞生长比较旺盛的组织中表达水平相对较高;Me14-3-3XV在茎尖分生组织中表达量相对较高;Me14-3-3I、Me14-3-3III、Me14-3-3V和Me14-3-3XVI在块根中有相对较高的表达水平。木薯Me14-3-3基因在不同品种不同发育阶段的表达模式分析表明:绝大多数Me14-3-3基因表达量在不同品种中都是随着块根的发育先有增加趋势,然后再有降低趋势,木薯块根形成期的Me14-3-3基因表达量决定了块根淀粉的积累。结合iTRAQ分析结果,这些蛋白质Me14-3-3I、Me14-3-3III、Me14-3-3VII、Me14-3-3VIII和Me14-3-3XVI参与了木薯块根淀粉的积累过程。5、Me14-3-3蛋白质亚细胞定位结果表明:16个Me14-3-3-GFP融合蛋白质在烟草叶片细胞的表达部位不尽相同,一些是均匀分布在整个细胞中,而一些主要在分布在细胞核和细胞膜,细胞质分布的比较少。6、在木薯中过量表达和敲除Me14-3-3基因,用潮霉素对植株进行筛选,通过PCR检测,验证到表达载体1300-Me14-3-3-GFP和基因编辑载体Cas9/s RNA的T-DNA已经重组到SC8木薯基因组上。
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