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[目的]
1.利用α-亚麻酸(ALA)及转化生长因子β1(TGF-β1)同时干预肝星状细胞(HSC),探讨干预前后HSC增殖及分泌功能。
2.比较干预后各计量对增殖及分泌功能影响程度,并探讨其可能的作用机制。
[方法]
1.采用活化的肝星状细胞作为研究模型,将传代的细胞分为5组,分别是A组(空白对照组)、B组(TGF-β15ng/ml)、C组(TGF-β15ng/ml+ALA50 mmol/L)、D组(TGF-β15ng/ml+ALA150 mmol/L)、E组(TGF-β15ng/ml+ALA250mmol/L)。
2.MTT比色法检测α-亚麻酸对HSC的增殖效应,并确定α-亚麻酸的有效浓度。
3.细胞贴壁培养24小时后,分组加入不同试剂及MTT液培养4小时,以MTT法检测细胞增殖活性。
4.经上诉分组及处理,收集药物处理后上清液,以ELASA法检测细胞培养上清液中Ⅰ型及Ⅲ型胶原的含量。
5.收集各组细胞以Western blot法检测ALA对TGF-β1诱导的HSC表达的α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的影响。
[结果]
(1)组间比较F=25.07,P<0.05,差异有统计学意义。LSD法多重比较可以发现ALA对HSC的增殖有抑制作用(B、C、D、E四组各组间差异有统计学意义,P<0.05,A组与E组间差异无统计学意义,P>0.05),并呈剂量依赖性,A组与E组间无统计学差异可能为ALA对HSC的抑制作用与TGF-β1对HSC的增殖作用相互抵消所致。TGF-β1对HSC的增殖有促进作用(A组与B、C、D组比较,P<0.05)。
(2)Ⅰ型及Ⅲ型胶原蛋白的表达:Ⅰ型胶原纤维蛋白组间比较,F=19.41,P<0.01,差异有统计学意义;Ⅲ型胶原纤维蛋白组间比较,F=16.66,P<0.01,差异有统计学意义,抑制作用呈剂量依赖性(P<0.05)。LSD法多重比较可以发现TGF-β1可促进HSC分泌Ⅰ型及Ⅲ型(P<0.01),而ALA对Ⅰ型及Ⅲ型胶原蛋白的分泌均有一定的抑制作用(B、C、D、E四组各组间差异有统计学意义,P<0.05,A组与E组间差异无统计学意义,P>0.05,A组与E组间无统计学差异可能为ALA对HSC的抑制作用与TGF-β1对HSC的增殖作用相互抵消所致),并呈剂量依赖性(P<0.05)。
(3) Western blot检测α-SMA的表达:α-SMA组间比较F=226.31,P<0.01,差异有统计学意义。LSD法检验可以看出TGF-β1能明显促进HSC表达α-SMA(P<0.01),经ALA作用后,TGF-β1诱导的α-SMA表达受到抑制并呈剂量依赖性(P<0.05)。
[结论]
1.TGF-β1能诱导HSC增殖,并使其分泌胶原能力增加,提示TGF-β1可能为肝纤维化发展过程中起重要作用。
2.α-亚麻酸在高浓度(150、250 mmol/L)时对TGF-β1能诱导的肝星状细胞能起抑制作用,可阻止以TGF-β1为主的细胞因子等对肝星状细胞的刺激效应,可能在一定计量时对肝纤维化的进程具有阻止作用。低浓度α-亚麻酸(50 mmol/L)作用不明显。