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背景与目的:弥漫大B细胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma,DLBCL）是非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin’s lymphoma,NHL）中最常见的一种。国内淋巴瘤病理学统计资料显示,DLBCL在中国人NHL中约占55%。它是一组临床表现、形态学、免疫表型和遗传学都具有明显异质性的淋巴瘤。根据基因表达谱（gene expression profile,GEP）的差异,DLBCL至少可以分为两种预后明显不同的亚型:生发中心B细胞型（germinal center B-cell,GCB）和外周血活化B细胞型（activated B-cell,ABC）。对GCB-DLBCLCHOP化了和R-CHOP免疫化疗疗效较好:而上述化疗对ABC-DLBCL效果不佳。尽管CD20单克隆抗体联合化疗的运用使得DLBCL的整体长期生存显著提高,但是仍有1/3左右的患者,表现为原发性耐药或者缓解后复发。这种对治疗反应的不一致以及预后的差异也是DLBCL异质性的表现之一。DLBCL的经典化疗方案是以蒽环类药物为主的CHOP方案（环磷酰胺cyclophosphamide,阿霉素doxorubicin（Dox）,长春新碱vincristine,和强的松prednisone）。作为主要核心药物的阿霉素的抗肿瘤机制主要包括两个方面:1.阿霉素和DNA交联,阻断拓扑异构酶II介导的DNA修复;2.产生活性氧破坏细胞膜。叶教授实验室尚未发表的研究结果表明阿霉素在不同亚型DLBCL中杀伤肿瘤细胞的机制不同,在ABC-DLBCL中主要以产生氧自由基杀伤肿瘤细胞为主,而在GCB-DLBCL中主要以破坏肿瘤细胞的DNA为主。我们据此推测ABC-DLBCL中的氧化环氧状态应该能够调节肿瘤细胞的对Dox的敏感性。xCT是一种具有12个跨膜结构域的转运蛋白,专司胱氨酸（CySS）从胞外转向胞内,同时将谷氨酸转出胞外。细胞内CySS被还原为半胱氨酸（Cys）后,参与还原型谷胱甘肽（glutathione,GSH）的合成。而GSH作为细胞内分布最广的非蛋白类巯基抗氧化物,与氧化型谷胱甘肽（CSSC）在细胞内保持氧化还原状态的动态平衡。既往研究提示xCT参与调节与多种肿瘤的增殖、迁移和耐药性。在乳腺癌和胃肠癌肿瘤中,CD44v8-10能够通过稳定xCT的结构参与调解肿瘤细胞内GSH的合成。但是在DLBCL中,xCT是否能够通过调整肿瘤细胞的氧化还原状态介导肿瘤细胞对化疗的敏感性,目前并不明确。为此,我们拟探讨xCT在DLBCL,特别是在ABC-DLBCL中,对肿瘤细胞的氧化还原状态、增殖、凋亡的影响及其可能的机制,进而为DLBCL预后的判断,及新的治疗途径提供思路。研究对象与方法:1、xCT在DLBCL中的表达分布及其与CD44V8-10的关系:选择14中DLBCL细胞株（8种ABC-DLBCL株,5种GCB-DLBCL株）通过qRT-CR,Western blot和流式细胞术（Flow CytoMetry,FCM）分别检测xCT及CD44的表达,评价其在不同DLBCL亚型中的表达差异及xCT与CD44v8-10的关系。2、xCT及其抑制剂柳氮磺吡啶（sulfazalazine,SASP）对ABC-DLBCL细胞增殖、凋亡的影响及其可能的机制通过xCT siRNA沉默SuDHL2和Riva两种细胞株中xCT的表达,qRT-CR和Western blot评价干扰效果。分别运用Dox处理对照组和实验组细胞,比较两组细胞在增殖及凋亡方面的差异,FCM评价两组ROS水平的差异。Western blot评价氧化应激相关信号转导通路蛋白p38 MAPK/p-p38MAPK、JNK/p-JNK,及凋亡调节蛋白Bax、Bim、Mcl-1、Bcl-2及Caspase的激活状态。运用xCT抑制剂SASP分别处理SuDHL2和Riva两种细胞株,比较对照组和实验组在增殖和凋亡方面的差异,FCM评价两组的ROS水平的差异。Western blot评价相关信号转导通路蛋白p38 MAPK/p-p38MPK、JNK/p-JNK,及凋亡调节蛋白 Bax、Bim、Mcl-1、Bcl-2 及 Caspase 的激活状态。3.xCT抑制剂SASP增强肿瘤细胞对Dox的敏感性及其可能的机制。分别联合SASP和Dox处理SuDHL2和Riva细胞,比较对照组和实验组在增殖、凋亡、ROS及GSH方面的差异。同时通过Western blot评价氧化应激相关信号转导通路蛋白p38 MAPK/p-p38 MAPK、JNK/p-JNK及凋亡调节蛋白Bax、Bim、Mcl-1、Bcl-2 及 Caspase 的激活状态。联合Glutathione ethyl ester（GEE）和 SASP 及 Dox 处理 SuDHL2 和 Riva细胞,比较对照组和实验组在增殖、凋亡、ROS及GSH方面的差异。同时通过Western blot评价氧化应激相关信号转导通路蛋白p38 MAPK/p-p38 MAPK、JNK/p-JNK及凋亡相关蛋白PARP的表达。联合p38抑制剂SB203580和SASP及Dox处理SuDHL2和Riva细胞,比较对照组和实验组在增殖及凋亡方面的差异。同时通过Western blot评价氧化应激相关信号转导通路蛋白p38 MAPK/p-p38 MAPK及凋亡相关蛋白PARP的表达。4.统计学分析两组计量资料比较用两独立样本t检验,各组数据以均数士标准差描述。多组均数比较用单因素方差分析,Levene检验方差齐性,若方差齐使用LSD方法进行多重比较,若方差不齐则使用采用近似F检验（Welch方法）代替方差分析后采用Dunnett’s T3方法进行多重比较。以p<0.05认为具有统计学差异。所有实验至少重复3次,应用SPSS 13.0软件进行数据分析。结果:1、xCTmRNA在所有的14中DLBCL细胞株中均有表达,独立样本t检验的结果显示xCT mRNA在ABC-DLBCL细胞株中的的表达水平高于GCB-DLBCL 细胞株,但差别无统计学意义（t=2.323,P=0.053）。Western Blot的结果显示xCT在所有的DLBCL细胞株中均有表达,独立样本t检验结果显示两种DLBCL亚型之间Western blot灰度值总体方差齐（F=0.004,P=0.948）,xCT的表达水平在ABC-DLBCL和GCB-DLBCL两种亚型之间无显著性差异（t=0.328,P=0.750）。CD44 mRNA和蛋白在所有的DLBCL细胞株中均有表达。CD44 mRNA在ABC-DLBCL细胞株中的表达水平显著高于GCB-DLBCL细胞株（t=2.745,P=0.029）。FCM的结果显示CD44膜蛋白在ABC-DLBCL细胞株中的表达水平显著高于 GCB-DLBCL 细胞株（t=2.878,P=0.045）。CD44v8-10只在ABC-DLBCL细胞株Pfeiffer细胞株中表达,而在其余的ABC-DLBCL和GCB-DLBCL细胞株无表达。提示在DLBCL细胞株中xCT的表达与CD44v8-10可能无明显相关性。2、xCT siRNA转染Riva及SuDHL2细胞后分别与48h、72h及96h采用RIPA裂解液提取蛋白,Western Blot评价xCT的表达水平。结果发现在Riva细胞中xCT表达稳定,xCT siRNA处理96h后,xCT仍无明显降低。同样的是在SuDHL2中xCT siRNA处理72h后,xCT仍无明显降低。蛋白抑制剂Cycloheximida分别处理 Riva、SuDHL2 及 Ly3-S 细胞 4h、8h、12h、16h、24h、48h 后,用 RIPA裂解液提取蛋白。以c-myc为阳性对照,Western Blot评价xCT及c-myc的表达,结果发现在Riva、SuDHL2及Ly3-S接受处理后的4h,细胞内c-myc的表达已完全消失,而即使处理48h之后xCT的表达并无明显降低。提示xCT具有很长的半衰期。xCT的抑制剂SASP在极低浓度时能够促进细胞增殖,而在高浓度时则抑制肿瘤细胞的增殖。以SASPIC50时的浓度分别处理Riva和SuDHL2细胞24h后,能够明显降低Riva和SuDHL2细胞内的GSH水平（P<0.001,0.001）,同时升高细胞内ROS的水平（P<0.001,0.001）。SASP分别处理Riva和SuDHL2细胞12及24小时后,能够明显促进氧化应激下游蛋白p-p38MAPK的激活。同时凋亡抑制蛋白Mcl-1、Bcl-2降低,而凋亡相关蛋白CleavedPARP、Bax、Bim表达水平上调。3、和Dox单药处理组相比,SASP联合Dox能够抑制Riva（F=877.265,P<0.001）和 SuDHL2 细胞（F=106.021,P<0.001）的增殖,增加 Riva（F=1131.469,P<0.001）和 SuDHL2 细胞（F=3332.651,P<0.001）的凋亡,提高 Riva（F=459.84,P<0.001）和 SuDHL2 细胞（F=472.63,P<0.001）的 ROS 水平。Western Blot的结果显示Dox联合SASP能够增加氧化应激相关蛋白p-p38 MAPK及p-JNK的表达。同时上调凋亡相关蛋白Cleaved PARP、Bax、Bim在Dox和SASP联合组的表达水平,抑制凋亡抑制蛋白Bcl-2及Mcl-1的表达水平。在Riva和SuDHL2细胞中,GEE预处理细胞后,再联合SASP及Dox能够降低SASP联合Dox所诱导的ROS的水平（P<0.001,<0.001）,减少二者所诱导的细胞凋亡（P<0.001,0.001）。Western Blot的结果显示GEE能够抑制SASP联合Dox所诱导的p38及JNK的磷酸化,同时抑制PARP的水解。在Riva和SuDHL2细胞中,p38抑制剂预处理细胞后,再联合SASP及Dox能够减弱SASP联合Dox所诱导的细胞毒效应（P<0.001,0.001）,减少二者所诱导的细胞凋亡（P<0.001,0.001）。Western Blot的结果显示p38抑制剂能够同时抑制PARP的水解,但是对于p38的磷酸化无明显影响,结论:1.xCT mRNA和蛋白在所有ABC-DLBCL细胞株和GCB-DLBCL细胞株中均有表达,其中xCT mRNA在ABC-DLBCL的表达水平高于GCB-DLBCL细胞株,但是二亚型之间的蛋白表达水平无明显差异。CD44 mRNA和蛋白在ABC-DLBCL细胞株和GCB-DLBCL细胞株中均有表达,且CD44 mRNA和蛋白在ABC-DLBCL细胞株中表达水平明显高于GCB-DLBCL细胞株。在14中DLBCL细胞株中,只有Pfeiffer细胞株中检测到CD44v8-10表达,提示在DLBCL中CD44v8-10可能不是调节xCT的主要因子。2.xCT表达在所检测的3种ABC-DLBCL中稳定表达,具有很长的半衰期。xCT抑制剂SASP能够降低ABC-DLBCL细胞内GSH的水平,同时升高ROS水平,诱导凋亡,增加氧化应激相关蛋白p-p38MAPK及p-JNK的表达。同时诱导凋亡相关蛋白Cleaved PARP、Bax、Bim表达上调,抑制抗凋亡蛋白Bcl-2及Mcl-1的表达,促进肿瘤细胞凋亡,抑制其增殖活性。3.SASP联合Dox能够进一步升高ABC-DLBCL细胞内ROS水平,增加氧化应激相关蛋白p-p38 MAPK及p-JNK的表达。同时诱导凋亡相关蛋白Cleaved PARP、Bax、Bim表达上调,抑制抗凋亡蛋白Bcl-2及Mcl-1的表达,促进肿瘤细胞凋亡,抑制其增殖活性。从而增强ABC-DLBCL肿瘤细胞对Dox的敏感性。ROS水平的增加和p38的激活是SASP和Dox联合诱导细胞凋亡的决定性因素。