【摘 要】
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研究目的:通过观察采用“腹侧化”及“尾侧化”模式的分化方案调控人胚胎干细胞向中脑黑质多巴胺能神经元分化的可行性及效果,以便建立一种使人胚胎干细胞特异性向黑质多巴胺能神经元分化,而且效率高,培养成本相对较低,适合批量生产,可以满足临床移植和药物筛选、离体模型研究等需要的分化方案。方法:1、“腹侧化”及“尾侧化”模式的分化方案诱导人胚胎干细胞分化1)第一阶段为人胚胎干细胞分化为中脑多巴胺能神经祖细胞。
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研究目的:通过观察采用“腹侧化”及“尾侧化”模式的分化方案调控人胚胎干细胞向中脑黑质多巴胺能神经元分化的可行性及效果,以便建立一种使人胚胎干细胞特异性向黑质多巴胺能神经元分化,而且效率高,培养成本相对较低,适合批量生产,可以满足临床移植和药物筛选、离体模型研究等需要的分化方案。方法:1、“腹侧化”及“尾侧化”模式的分化方案诱导人胚胎干细胞分化1)第一阶段为人胚胎干细胞分化为中脑多巴胺能神经祖细胞。使用人胚胎干细胞H9和HN4,分别在基质胶和人重组层粘连蛋白-111包被的培养板上采用单层贴壁培养法,定向诱导分化16天。基础神经培养基为N2、B27培养基。加入因子为10μM Y-27632、10μM SB431542、100ng/m L头蛋白。为促进其“腹侧化”及“尾侧化”,培养基中再加入300ng/m L Shh-C24II和0.7μM CHIR99021。在分化第9天,加入100ng/m L成纤维细胞生长因子8b（FGF8b）。在分化第11天,加入20 ng/m L脑源性神经营养因子（BDNF）、0.2m M L-抗坏血酸（AA）、100ng/m L FGF8b,促进中脑多巴胺能神经祖细胞的定型和区域化。2)第二阶段为中脑多巴胺能神经祖细胞的分化成熟,在分化第16天,加入20ng/m L BDNF、0.2m M AA、10ng/m L胶质细胞源性神经营养因子、500μM环化腺核苷一磷酸、1μMγ-分泌酶抑制剂,在上述培养条件下继续培养至42天,保证其分化为成熟的多巴胺能神经元。2、不同培养阶段细胞样本检测1)采用倒置相差显微镜检测细胞形态学变化;2)细胞免疫荧光检测中脑多巴胺能神经元相关标记物络氨酸羟化酶（TH）、微管相关蛋白2（MAP2）、叉头框转录因子A2（FOXA2）、LIM同源盒转录因子1（LMX1）、Orthodenticle同源框2（OTX2）、G蛋白激活内流钾通道蛋白2（GIRK2）、钙结合蛋白1（Calbindin1）等蛋白表达;3)实时荧光定量PCR（q PCR）检测TH、FOXA2、LMX1、A9（黑质致密部）多巴胺能神经元标记物GIRK2、A10（腹侧被盖区）多巴胺能神经元标记Calbindin1、Bar H同源框1（BARHL1）等相关基因表达;4)蛋白免疫印迹检测TH、FOXA2、LMX1、GIRK2等相关蛋白表达。结果:1、相同定向诱导条件下,在基质胶包被的培养板上的贴壁细胞数量、存活量、细胞产量较人重组层粘连蛋白-111上的数量多。2、本实验整个过程在基质胶包被的培养板上进行,细胞形态从典型干细胞形态-铺路石样逐渐分化为典型成簇多巴胺能神经元形态-梭形或多角形。3、细胞免疫荧光结果显示,在分化第16天,可见大量FOXA2+/LMX1+/OTX2+的腹侧中脑祖细胞,约占总细胞35%。在分化第42天,可见大量GIRK2+/TH+、FOXA2+/LMX1+、TH+/MAP2+、GIRK2+/LMX1+等细胞。4、qPCR结果显示:与胚胎干细胞相比,在分化第16天,细胞样本中可见FOXA2、LMX1、丘脑底核（STN）神经元标记物BARHL1、TH高表达（P<0.05）;GIRK2、Calbindin1表达轻度升高（P<0.05）。与第16天相比,分化第42天细胞样本中可见FOXA2、LMX1、BARHL1表达较16天有所下降（P<0.05）,但GIRK2、Calbindin1和TH明显升高（P<0.05）。5、蛋白免疫印迹检测结果显示:分化第42天,中脑多巴胺能神经元标记TH、FOXA2、LMX1均有表达,GIRK2表达明显升高。6、一定范围内调控CHIR99021浓度结果显示,随着CHIR99021浓度的不断增加,FOXA2阳性细胞数不断增加,而对LMX1+/OTX2+细胞数影响不大,在0.8μM时阳性细胞数最高。结论:1、基质胶作为包被剂可用于干细胞定向诱导分化,其促细胞粘附和细胞存活效果优于人重组层粘连蛋白-111的效果,并具有一定的经济价值。2、采用“腹侧化”及“尾侧化”模式的分化方案,可以将人胚胎干细胞分化为大量A9多巴胺能神经元,并且在形态学改变、蛋白水平、基因水平上证实其中脑多巴胺能神经元特征,证实本方案是有效可行的。3、“尾侧化”诱导因子CHIR99021浓度与腹侧中脑祖细胞阳性率密切相关,一定范围内随CHIR99021浓度增加而增加。4、本研究方案所获得的神经元中主要为A9多巴胺能神经元,但仍包括少量的丘脑底核神经元和A10多巴胺能神经元,说明本方案仍然不十分完美,有进一步优化的可能性。
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