基于多巴胺表面交联的高性能固定化酶用于多肽制备的动力学特性研究

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抗氧化多肽需求量日渐增加,但是所得产物需近一步分离、提纯。二氧化硅(SiO2)微球具有制备技术简便、成本低、无毒、刚性好、耐细菌溶解性和热稳定能力较高等优点。多巴胺(DA)在弱碱性条件自发进行自聚合反应,几乎能够修饰任何材料。因此,本论文以SiO2为载体固定化胰蛋白酶,采用PDA交联法对SiO2微球进行修饰。利用固定化酶解法研究动力学参数调控与酶固相反应过程是否存在一定的科学关系,通过参数调控以期达到对酶解多肽精准分离效果。本论文主要包括以下几个部分:1.SiO2微球的制备和表面修饰本研究通过St(?)ber法合成不同规格大小的SiO2微球。以氨水添加量、正硅酸四乙酯(TEOS)添加量和正硅酸四乙酯(TEOS)加入时间为变量,通过透射电镜(TEM)、傅里叶变换红外光谱(IR)和粒度分析仪对所制备SiO2进行表征,其结果表明分批加入TEOS合成SiO2微球分散性、形态规则性、粒径均一性优于一次性加入,所得最优条件为氨水添加量为1mol/m L,首先加入0.4 mol/m L TEOS反应5 h后再加入0.8 mol/m L TEOS得到粒径大小为723 nm的微球。对自制SiO2载体进行表面修饰。通过多巴胺(DA)交联法对自制SiO2微球进行修饰,实验得最适DA修饰时间为2 h,最适DA浓度为1 mg/m L。2.SiO2@PDA固定化酶条件的研究以酶的固定量、水解度和酶活性为检测指标,对酶固定化条件进行优化。以SiO2@PDA为载体,确定了固定化酶最适条件,在p H 8.0的PBS缓冲液,固定化4 h,酶固定量可达2.5 mg/g,相对酶活力可达95%以上。通过改变p H、温度、时间、酶添加量等参数,确定SPE最优酶解条件:最适p H=8.0,最适温度40℃,底物浓度为3%水解度可达23%。3.动力学参数调控与酪蛋白水解产物关系通过改变酶解动力学参数来研究参数改变与水解产物分子量之间的动力学关系。确定了液相条件,结果表明通过改变反应时间、温度、p H、流量等会对多肽分布有一定影响,多肽分子量出现一定的聚集性。并对水解产物进行了抗氧化分析,其发现其水解产物具有良好的羟基自由基清除力,清除力可达80%以上。
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