目的检测胰岛素对肝细胞GABARAPL1表达的影响,并进一步探讨胰岛素对其转录调控的机制。方法体外培养人永生化肝细胞(HL-7702),将细胞分为五组:A组(对照组)、B组(自噬激活组)、C组(胰岛素组)、D组(胰岛素阻断组1)、E组(胰岛素阻断组2),处理方法如下:除A组外均加入100nM雷帕霉素处理6小时,C、D、E组再分别加入1μM胰岛素,其中D、E组需提前30分钟分别加入LY294002(50μM)、Wortmannin(100nM),4小时之后细胞处理完成。通过提取各组细胞蛋白质样品,利用Western Blotting法检测自噬相关基因GABARAPL1、LC3、Beclin1的表达情况,同时可借助透射电镜观察各组细胞内自噬小体数量的表达差异。随后通过前期已成功构建的胰岛素调控识别模序失活突变体,及含有GABARAPL1启动子序列的荧光素酶报告系统,利用Luciferase Assay检测荧光素酶活性,并比较其转录活性差异,寻找参与胰岛素对GABARAPL1转录调控的反应元件,最后通过非放射性凝胶迁滞实验对该转录调控的结合位点予以确认。结果1.Western Blotting结果示:相比于B组,C胰岛素组可见GABRABPAL1、LC3、Beclin1表达减弱(P<0.05);相比C组,D胰岛素阻断组可见GABRABPAL1、LC3、Beclin1表达增强(P<0.01)。2.透射电镜下观察自噬小体的变化:相比于B、D、E组,C胰岛素组自噬小体数目明显减少。3.荧光素酶活性检测:失活GABARAPL1基因启动子区域内IRE1反应元件,其转录活性明显下降(P<0.01)。4.非放射性凝胶迁滞实验检测:与其它阴性对照组相比,自噬激活组及胰岛素阻断组可见其核蛋白质与标记探针(biotin-FoxO1)形成的滞后结合带,自噬激活组核蛋白质与标记探针及FoxO1抗体所形成的结合带更为明显且滞后,胰岛素组内其结合带明显减弱。结论1.胰岛素抑制肝细胞GABARAPL1的基因表达。2.胰岛素通过FoxO1与GABARAPL1基因启动子区域内IRE1反应元件的脱离,实现对肝细胞GABARAPL1转录活性的调控。