健脾理气方联合吉非替尼对HepG2细胞的抑制作用及机制研究

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目的:采用人肝癌细胞HepG2进行体外培养实验,观察健脾理气方(Jianpiliqifang, JPLQF)及其有效成分熊果酸(ursolic acid, UA)联合吉非替尼(gefitinib, G)对人肝癌细胞HepG2的生长抑制作用,探讨联合抗肿瘤增敏机制。方法:选取人肝癌细胞,HepG2作为研究对象,接种在含10%胎牛血清、1%的青链霉素双抗的DMEM中,置37℃、5%C02、相对湿度90%的培养箱中培养,每3-4d传代1次。取对数生长期的HepG2细胞种板,培养24h后加药。实验分成以下各组:①JPLQF2、4、6、8、10、15、20mg/mL不同剂量组;②G20μM组;③JPLQF+G联合用药组;④空白组;⑤对照组;⑥UA5、15、20、25、30μM;⑦UA+G联合用药组,各组相应试剂处理后继续培养,进行以下实验:MTT法测定各组对细胞增殖的影响;Hoechst33258染色法于荧光显微镜观察细胞形态学变化;流式细胞仪检测细胞凋亡情况;Western Blotting检测DNMT1和EZH2蛋白表达的情况及对AMPKa和EGFR激酶磷酸化表达的影响。结果:1.健脾理气方及其有效成分熊果酸联合吉非替尼对人肝癌细胞HepG2增殖的影响不同浓度健脾理气方及其有效成分熊果酸对人肝癌细胞HepG2均具有显著的抑制增殖作用,且随药物浓度增大和作用时间的延长而增强,呈时间和剂量依赖关系。健脾理气方或熊果酸分别联合吉非替尼后,细胞增殖抑制率高于单独用药组,具有相加效应。2.健脾理气方及其有效成分熊果酸联合吉非替尼对人肝癌细胞HepG2凋亡的影响健脾理气方、熊果酸、吉非替尼、健脾理气方或熊果酸分别联合吉非替尼作用于人肝癌细胞HepG224h后,经Hoechst33258染色,荧光显微镜下可观察到肝癌细胞出现典型凋亡形态学变化,以联合作用时变化更明显。流式细胞仪检测发现健脾理气方和熊果酸能引起HepG2细胞早期凋亡,且具有一定的剂量依赖性。联合用药早期凋亡率升高,其促凋亡作用高于单独用药组。3.健脾理气方及其有效成分熊果酸联合吉非替尼对人肝癌细胞HepG2DNMT1和EZH2蛋白表达及相关激酶的影响健脾理气方、熊果酸、吉非替尼及健脾理气方或熊果酸联合吉非替尼作用人肝癌细胞HepG224h后,均能下调DNMT1及EZH2蛋白的表达水平,且两药联用DNMT1及EZH2蛋白的表达水平下调更明显。初步研究结果显示,健脾理气方10mg/mL或熊果酸20μM作用能增加AMPKα激酶磷酸化、减少EGFR激酶磷酸化。结论:1.健脾理气方、熊果酸、吉非替尼及健脾理气方或熊果酸联合吉非替尼均能抑制人肝癌细胞HepG2增殖,且联用的增殖抑制效果更强,具有相加效应。2.健脾理气方、熊果酸、吉非替尼及健脾理气方或熊果酸联合吉非替尼对人肝癌细胞株HepG2均具有诱导细胞凋亡作用,且联用后促凋亡效果更强。3.健脾理气方、熊果酸、吉非替尼及健脾理气方或熊果酸与吉非替尼分别联用能下调人肝癌细胞株HepG2DNMT1及EZH2蛋白表达水平,以联合作用较明显。4.健脾理气方10mg/mL或熊果酸20μM具有增加AMPKα激酶磷酸化、减少EGFR激酶磷酸化的作用。
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