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背景与目的:肿瘤耐药是临床上肿瘤治疗所面临的巨大难题,细胞发生谱系转换是肿瘤发生耐药的机制之一。小细胞神经内分泌癌(Small-cell neuroendocrine carcinoma,SCNC)是一类起源于所有上皮组织器官、恶性程度高、具有极高的侵袭性和转移能力、并伴有神经内分泌(Neuroendocrine,NE)表型的恶性肿瘤。顺铂和依托泊苷联合化疗是SCNC的标准治疗方案,患者往往在治疗早期反应十分敏感,但很快会在一年之内发生耐药和复发,并获得更高的转移能力。复发后的SCNC失去NE细胞表型,从NE谱系转换为non-NE谱系。此外,临床上也有一部分腺癌(包括14%的肺腺癌和20%-40%的前列腺腺癌)在接受化疗药或者靶向药治疗后可转变成NE癌而发生耐药。由此可见,肿瘤细胞在治疗耐药后发生NE与non-NE谱系转换的现象普遍存在,但其发生的表观遗传学机制仍不清楚。本文旨在找到NE与non-NE癌细胞之间发生谱系转换的关键调控因子,从而为SCNC的治疗,预防腺癌谱系向NE谱系转换,提供可供参考的治疗方案。方法:1.分离新鲜原发性SCLC临床组织样本进行10×Genomics单细胞转录谱测序(sc RNA-seq)。利用inferred CNV和UMAP进行分群(主要分为NE-SCLC和non-NE-SCLC两群)。利用转录因子binding motif enrichment分析富集出在NE-SCLC中活跃转录因子(发现神经/淋巴细胞特异性转录因子PAX5在NE-SCLC中显著激活)。2.免疫组化检测肺癌临床样本中PAX5的表达情况;在具有神经内分泌表型的非小细胞肺癌细胞系H1155中利用CRISPR/Cas9敲除PAX5,进行转录谱和细胞生物学行为的检测;并通过小鼠皮下植瘤实验探究细胞的行为学变化和对SCLC标准治疗药物的敏感性。3.在肺腺癌细胞系A549中过表达PAX5,通过裸鼠皮下植瘤实验探究细胞在体内的行为学变化;构建Tet-op-h PAX5 knock-in小鼠,与自发性肺腺癌转基因小鼠Tet-op-h EGFR-TD/CC10rt TA杂交,观察h PAX5/h EGFR-TD/CC10rt TA小鼠肺部肿瘤改变;通过microarray、Ch IP-Seq研究PAX5影响肿瘤细胞生物学变化的分子机制。4.对EGFR突变的肺腺癌细胞系HCC827过表达PAX5,进行皮下植瘤,检测PAX5是否影响肿瘤细胞对EGFR-TKIs药物Erotinib的敏感性。5.探讨肿瘤微环境对PAX5调控腺癌向神经内分泌癌转化的影响,对A549-PAX5的皮下瘤和h PAX5/h EGFR-TD/CC10rt TA小鼠肺部肿瘤及对照组进行新生血管免疫荧光双染;利用Bevacizumab对A549皮下植瘤小鼠进行体内药物实验,检测抑制血管生成对PAX5诱导腺癌向神经内分泌癌转化的影响。6.在前列腺癌中探讨PAX5促进non-NE向NE谱系转换的普遍性作用,检测PAX5在前列腺癌中的表达情况;PAX5异位表达后对前列腺腺癌细胞生物学行为改变和表达谱的改变。结果:1.PAX5调控NE与non-NE癌细胞之间发生谱系互换1.1PAX5是维系SCLC神经内分泌谱系的关键转录因子(1)确定神经/淋巴细胞特异性转录因子PAX5是在NE-SCLC细胞中活跃的转录因子。PAX5主要表达在具有神经内分泌表型的肺癌细胞系及组织中,只有10%的肺腺癌表达PAX5。(2)KO-PAX5-H1155细胞表达谱与SCLC sc RNA-seq中non-NE-SCLC表达谱一致,发生向non-NE细胞谱系转变;KO-PAX5-H1155细胞在体外培养的生长模式由悬浮生长转为贴壁生长;皮下植瘤体内实验结果表明KO-PAX5后的细胞转移能力增强(发生肾转移),原位瘤细胞病理形态转变为non-NE细胞形态且不表达NE标志物;对SCNC的标准化疗药物敏感性降低。1.2.PAX5是肺腺癌向SCLC谱系转换的驱动基因(1)A549-PAX5体内实验明显发生细胞向肺部转移,病理组织形态由腺癌转变为SCLC,NE标志物表达增高;h PAX5/h EGFR-TD/CC10rt TA小鼠肺部病理学和NE标志物的表达变化与A549-PAX5皮下瘤的变化一致。HCC827皮下植瘤,给予小鼠Erotinib药物处理后,HCC827-PAX5组对Erotinib耐药。2.PAX5直接调控神经内分泌通路相关基因的表达GESA分析A549-PAX5 microarray结果,发现PAX5上调神经内分泌相关通路的基因;PAX5可结合在这些神经内分泌相关基因的启动子区,进行直接调控。SCLC细胞系体外培养条件下呈悬浮生长,A549过表达PAX5,不能诱导细胞悬浮生长,但在体内却能够诱导肺腺癌向SCLC转化,提示这种现象可能依赖于肿瘤细胞与肿瘤微环境的相互作用。3.PAX5通过促进肿瘤微环境中血管生成以实现non-NE与NE谱系转换H&E染色发现A549-PAX5皮下瘤和h PAX5/h EGFR-TD/CC10rt TA小鼠肺部瘤内血管增多,经过CD105和α-SMA免疫荧光双染,确定这些血管新生血管。Bevacizumab处理A549-PAX5荷瘤小鼠抑制新生血管的生成后,明显减少肿瘤肺转移,抑制肿瘤从腺癌转化SCLC。PAX5过表达上调VEGFA、TNF-α等血管生成因子的表达。4.转录因子PAX5促进前列腺腺癌向SCPC谱系转换在SCPC细胞系和组织中PAX5高表达;在10%的前列腺腺癌(ADPC)组织样本中PAX5呈散在性低表达。在ADPC细胞系中异位表达PAX5能够促进前列腺腺癌谱系向NE谱系转化。RM-1-PAX5细胞原位瘤内血管增多,利用血管生成抑制剂能够有效阻止原位瘤发生肺转移和APDC向SCPC病理形态的转变。结论:本研究发现生理状态下仅表达于神经系统和淋巴细胞中的转录因子PAX5在上皮细胞癌中异位激活,是SCNC谱系维系的决定性因子,PAX5的缺失导致了SCNC失去神经内分泌特性而发生耐药,PAX5在腺癌中的异位激活会促进腺癌向SCNC转化而发生耐药。这些发现为临床上NE与non-NE癌细胞之间发生谱系转换的现象找到了分子机制;由于PAX5是公认的决定B淋巴细胞谱系分化决定性转录因子,因此,我们的发现还为淋巴细胞发育与SCNC分化之间提供了特定的分子关联,并为SCNC与淋巴瘤之间存在的组织学和临床相似性(包括转移能力、丰富的血管性)提供了机制上的解释。抑制PAX5促进的血管生成可阻止PAX5引起的non-NE肿瘤细胞向NE谱系转换,这些研究为SCNC的治疗和预防表达PAX5的腺癌向SCNC谱系转化提供了可参考的治疗方案。