论文部分内容阅读
目的:成骨不全（osteogenesis imperfecta,OI）是一种以骨质脆弱、骨畸形和反复骨折为主要临床特征的遗传性疾病,呈常染色体显性遗传,根据临床症状主要分为Ⅰ～Ⅳ型,由编码Ⅰ型胶原的COL1A1/COL1A2基因突变引起,但发病机制不同。群体中Ⅰ型患者数量最多,由于患者体内虽然胶原含量下降但结构正常,所以症状较轻;Ⅲ型患者胶原结构发生改变,是存活患者中表型最严重的类型。目前,临床治疗OI的手段也较单一,疗效差异较大且有一定的副作用。本论文根据OI不同的发病原因,分别采用脂肪源性间充质干细胞（Adipose derived mesenchymal stem cells,ADSCs）联合特异性成骨因子NELL1间接补充正常Ⅰ型胶原和清除异常结构的Ⅰ型胶原两种策略,开展Ⅰ型和Ⅲ型OI模型小鼠的治疗,观其疗效,探究相关机制,为OI个体化治疗提供参考和依据。方法:1.采用特异性成骨因子NELL1联合ADSCs治疗Ⅰ型OI:（1）体外实验:采用q PCR检测rm NELL1重组蛋白对MC3T3-E1细胞系和ADSCs的成骨基因表达水平的影响,通过碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）染色和活性实验检测成骨能力;构建携带Nell1基因的慢病毒载体,探究Nell1基因过表达对ADSCs体外成骨基因的表达及成骨早期、晚期分化能力的影响。（2）体内实验:分别采用尾静脉注射PBS、rm NELL1、ADSCs、rm NELL1联合ADSCs（rm NELL1+ADSCs）及慢病毒介导的Nell1基因修饰的ADSCs（lenti-Nell1-ADSCs）对Ⅰ型OI的Col1a1+/-365模型小鼠进行治疗,同窝野生型（wild type,WT）小鼠作为正常对照;采用Micro-CT分析小鼠股骨骨小梁和骨皮质的微观结构,采用H&E染色和免疫组化染色评价各组骨形成情况,采用免疫荧光染色追踪植入的ADSCs在骨内的定位及分化情况,探究治疗相关机制。2、增强自噬能力清除异常胶原治疗Ⅲ型OI:（1）分离WT小鼠和Ⅲ型OI胶原异常的Col1a2oim/J模型小鼠皮肤成纤维细胞（Mouse dermal fibroblast cells,MDFs）,采用MDC染色、免疫荧光、western blot和透射电镜检测Col1a2oim/J小鼠MDFs内质网应激和自噬水平的改变;采用HSP47抑制剂—小分子Col003构建胶原异常细胞模型,在细胞水平上模拟Ⅰ型胶原结构异常,并采用MDC染色、免疫荧光、western blot和透射电镜评估该模型的内质网应激和自噬水平,验证Col1a2oim/J小鼠模型中自噬及内质网应激实验的结果。（2）采用RNA-seq检测WT型小鼠和Col1a2oim/J小鼠MDFs的差异表达基因,并对测序结果进行验证,确定影响Col1a2oim/J小鼠自噬水平的作用靶点,初步分析影响自噬的相关通路及作用机制,并据此确定治疗药物,采用western blot及免疫荧光探究该治疗药物干预自噬后对Ⅰ型胶原清除能力的影响,同时利用Col003模型进行进一步验证。（3）分离Col1a2oim/J小鼠颅骨来源的成骨细胞,在体外探究所选用的治疗药物干预自噬水平后对成骨细胞早期成骨能力的影响,使用该治疗药物对4周龄的Col1a2oim/J小鼠进行治疗,采用western blot对小鼠成骨指标进行检测,采用免疫组化染色评价治疗效果。结果:（1）中、高浓度的rm NELL1可以促进MC3T3-E1及ADSCs细胞成骨基因的表达,增强早期成骨能力。Nell1基因修饰的ADSCs成骨基因转录水平增加,矿化能力增强。（2）与OI+PBS组相比,rm NELL1联合ADSCs或lenti-Nell1-ADSCs全身输注可显著改善股骨微观结构,有效增加骨面积和胶原沉积,增强骨形成能力。GFP免疫染色显示部分静脉灌注的lenti-Nell1-ADSCs驻留于股骨,并分化为ALP阳性细胞,提示其参与了新骨形成。NELL1与ADSCs联合治疗比单独使用效果更好。（3）Col1a2oim/J小鼠MDFs中存在自噬过程的抑制,表现为细胞内自噬体异常积累,且一定程度上导致了细胞的内质网应激。Col003可以诱导细胞内自噬体的积累,并导致一定程度的内质网应激现象,出现与Col1a2oim/J小鼠MDFs相似的表型。（4）Col1a2oim/J小鼠及Col003模型均出现FGFR4异常高表达,影响了AKT3、AMPK、JNK多个信号的调控,进而导致了自噬过程的抑制。使用FGFR4抑制剂FGF401后能增加AKT3和AMPK的磷酸化,激活自噬相关通路,使自噬回到正常水平,加快细胞内异常胶原的降解。（5）FGF401在体外可以促进Col1a2oim/J小鼠的成骨细胞及Col003细胞模型的成骨分化;在体内可长期抑制FGFR4的表达,对小鼠股骨自噬水平有一定程度的激活作用,通过清除异常的胶原而改善小鼠体内成骨细胞的成骨能力,改善骨矿化功能。结论:1.NELL1具有较强的成骨能力,慢病毒介导的Nell1基因修饰使ADSCs的成骨潜能增强,使用rm NELL1/ADSCs协同治疗或对ADSCs进行Nell1基因修饰对骨量减少的Ⅰ型OI小鼠模型有良好的治疗效果。2.Col1a2oim/J小鼠及Col003细胞模型存在内质网应激及自噬水平受阻现象,抑制FGFR4的水平可以通过激活AKT3、AMPK、JNK等信号分子激活自噬,加快异常胶原的降解;FGFR4的抑制剂FGF401可以通过调节Col1a2oim/J小鼠体内的自噬水平,在清除体内异常胶原的基础上缓解成骨细胞的代谢异常,起到改善成骨能力的作用,可作为Ⅲ型OI的候选治疗药物。