论文部分内容阅读
研究目的:肺癌是最常见、死亡率最高的恶性肿瘤。肿瘤转移是阻碍肺癌临床有效治疗的关键问题,因此深入探究肺癌转移机制并开发针对性的治疗策略刻不容缓。肿瘤微环境因其可以从多个方面参与肿瘤的发生发展过程,近些年受到广泛关注。肿瘤相关成纤维细胞(cancer-associated fibroblasts,CAFs)是肿瘤微环境中最丰富的细胞成分之一,其能够通过直接接触或旁分泌的方式促进肿瘤的进展,因此成为实体肿瘤治疗的潜在靶点。细胞自噬是一种在进化上高度保守的细胞过程,其可以使细胞在面对营养物质缺乏等压力时通过批量降解细胞内容物得以存活。研究发现自噬过程在肿瘤发生、发展和治疗中至关重要。然而,CAFs的自噬水平以及其对肺癌细胞的增殖和侵袭转移的影响尚不清楚。因此,本研究从肺癌CAFs的自噬水平入手,利用自噬抑制和激活剂等材料和方法,系统探究CAFs的自噬水平在CAFs对肺癌细胞增殖和侵袭转移的影响中的作用,并进一步探究发挥作用的关键因子及作用机制。本研究可以加深对肺癌转移机制的理解,并为肺癌的治疗提供新策略。方法:一、体外研究1.CAFs的分离培养和自噬水平的检测:从肺癌临床标本中分离、培养、鉴定CAFs和正常成纤维细胞(normal fibroblasts,NFs),通过Western blot、GFP-LC3斑点化实验以及吖啶橙染色等实验方法,检测NFs和CAFs的自噬水平。2.抑制CAFs的自噬对CAFs促进肺癌细胞增殖、侵袭和迁移作用的影响:运用自噬特异性抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)、氯喹(chloroquine,CQ)干预CAFs,或者通过RNAi方法敲低CAFs中自噬基因ATG5的表达,收集干预后CAFs的条件培养基(CAF-conditioned medium,CAF-CM),用此CAF-CM培养肺癌细胞。通过CCK-8实验、细胞划痕实验和Transwell小室实验检测抑制自噬后CAFs对肺癌A549细胞和H661细胞增殖、侵袭和迁移的影响。同时通过定量PCR和Western blot检测肺癌细胞中转移相关基因(MMP2、Twist、MMP9)和上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)相关标志物(E-cadherin、N-cadherin、Vimentin)的表达水平变化。3.激活CAFs的自噬对CAFs促进肺癌细胞增殖、侵袭和迁移作用的影响:运用自噬特异性激活剂雷帕霉素(rapamycin,RAPA)干预CAFs,收集干预后的CAF-CM,用此CAF-CM培养肺癌细胞。通过CCK-8实验、细胞划痕实验、Transwell小室实验以及Western blot检测激活自噬后,CAFs对肺癌细胞增殖和侵袭转移作用的影响以及对肺癌细胞中转移和EMT相关基因蛋白表达水平的影响。4.CAFs的自噬水平对高迁移率族蛋白B1(high mobility group box protein 1,HMGB1)分泌的影响:Western blot检测NFs和CAFs中HMGB1的表达水平,通过ELISA检测肺癌细胞、NFs和CAFs等不同细胞的HMGB1分泌水平。运用3-MA、CQ、RAPA干预CAFs或者通过RNAi方法敲低CAFs中ATG5的表达,通过ELISA检测调控CAFs自噬水平后对CAFs分泌HMGB1的影响。5.HMGB1对CAFs自噬水平的影响:用HMGB1重组蛋白处理CAFs,通过GFP-LC3斑点化实验及Western blot检测用HMGB1干预后CAFs自噬水平的变化。6.CAFs分泌的HMGB1对肺癌细胞增殖和侵袭转移的影响:用加入HMGB1中和抗体或HMGB1抑制剂的CAF-CM,或者用加入HMGB1重组蛋白的正常培养基培养肺癌细胞,通过CCK-8实验、细胞划痕实验、Transwell小室实验以及Western blot检测CAFs分泌的HMGB1对肺癌细胞增殖和侵袭转移的影响。7.CAFs分泌的HMGB1对肺癌细胞TLR4/NF-κB信号通路的影响:收集3-MA、CQ、RAPA或si ATG5干预CAFs后的CAF-CM培养肺癌细胞,Western blot检测调控CAFs自噬水平后CAFs对肺癌细胞中TLR4/NF-κB信号通路中关键信号分子TLR4、p-IκBα、IκBα和p-p65表达水平的影响,并结合HMGB1中和抗体及HMGB1重组蛋白评估CAFs分泌的HMGB1在肺癌细胞TLR4/NF-κB信号通路中的作用。二、体内研究裸鼠体内实验验证:将经CQ预处理的CAFs与A549混种于裸鼠背部皮下建立皮下瘤模型,同时设立未处理的CAFs为对照,饲养5周后剥离肿瘤组织,测量肿瘤组织的体积及重量,并通过Western blot检测肿瘤组织中TLR4/NF-κB信号通路中关键信号分子、转移相关基因、EMT相关标志物的表达水平。结果:1.肺癌CAFs的基础自噬水平高于NFs。2.降低CAFs的自噬水平可以减弱CAFs对肺癌细胞增殖和侵袭转移的促进作用,削弱CAFs对肺癌细胞中转移相关基因MMP2、Twist、MMP9和间质标记物N-cadherin、Vimentin表达的上调作用以及上皮标记物E-cadherin表达的下调作用。3.提高CAFs的自噬水平可以增强CAFs对肺癌细胞增殖和侵袭转移的促进作用,促进CAFs对肺癌细胞中转移相关基因和间质标记物表达的上调作用以及上皮标记物表达的下调作用。4.与NFs和肺癌细胞相比,CAFs能够分泌更多的HMGB1。调控CAFs的自噬水平可影响CAFs分泌HMGB1;并且HMGB1能够进一步上调CAFs的自噬水平,表明CAFs和HMGB1之间具有正反馈调节作用。5.CAFs分泌的HMGB1激活肺癌细胞中的TLR4/NF-κB信号通路,进而促进肺癌细胞的增殖和侵袭转移。6.体内研究显示,CAFs促进肺癌细胞的体内生长。抑制CAFs的自噬水平能够有效减弱CAFs对肺癌细胞EMT及TLR4/NF-κB信号通路的激活作用,进而减弱CAFs促进肺癌细胞体内生长的作用。结论:1.肺癌的CAFs具有较高的基础自噬水平。2.CAFs高水平的自噬介导了CAFs促进肺癌细胞增殖及侵袭转移的作用。3.CAFs的高自噬水平与CAFs分泌的HMGB1之间存在正反馈调控关系。4.CAFs通过分泌HMGB1,激活肺癌细胞中TLR4/NF-κB信号通路,促进肺癌细胞增殖及侵袭转移。5.抑制CAFs的自噬水平能够有效减弱CAFs促进肺癌细胞在体内的生长。