提高番茄耐盐及抗旱性的转基因技术研究

来源 :内蒙古农业大学 | 被引量 : 3次 | 上传用户:hwhxl0
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本研究采用的耐盐抗旱基因Force是从拟南芥中分离出的一种携带转录辅因子的AT-hook DNA突变体,通过将此基因重组连接表达载体pBIN19,再利用农杆菌介导的番茄叶盘转化法来获取番茄转基因植株,在对番茄Money maker品种进行耐盐抗旱基因Force的遗传转化中,得到的主要研究结果如下:1、将基因Force成功重组连接于表达载体pBIN19。然后通过电击转化法,将所重组构建的载体质粒转入到农杆菌LAB4404菌株中,得到含有Force基因的工程农杆菌;提取所得质粒DNA,通过PCR,且XbaI, SmaI双酶切质粒DNA,双重验证鉴定结果表明Force基因已插入到pBIN19载体中,表明已经成功构建了实验必需的含有目的基因Force的表达载体,同时也成功构建含有目的基因Force的工程农杆菌。2、实验借鉴前人研究经验,成功优化构建了高效的番茄转化再生体系。此体系的重要性得到了极大的体现,从质粒载体成功构建,到获得转基因T0代植株,必须通过番茄的高效再生遗传转化体系,否则一切都不能实现。通过对生长激素Trans-zeatin的使用,大大增加了出愈率和出芽率,使用抗生素Tim对所得转基因苗进行连续地筛选,同时确定潮霉素Hyg对于番茄Money maker品种的适宜选择压为5mg/L。且在生根阶段使用激素IBA促进转基因苗的生根,大大提高了阳性转基因苗的数目;从而减少了实验后期的鉴定和栽培管理的工作量。3、得到了含有耐盐抗旱Force基因的16株T0代转基因苗,且收获了T1代种子,为下一步获得优良、稳定的耐盐抗旱遗传特性的品种打下了基础。转基因植株的基因型上,PCR鉴定证实Force基因在番茄基因组中得到了整合,且对植株进行RT-PCR分析,检测结果表明导入的Force基因能在番茄T0代中有不同程度的表达。最后通过Southern印迹杂交检测发现基因组DNA经SmaI单酶切后,外源DNA在番茄基因组中有不同的插入位点,确证目的基因Force已插入并整合到番茄基因组上。转基因植株的表型上,植株大部分表现为枝叶生长旺盛,株型高大粗壮,具有很多丛生且皱簇的叶子,且叶片面积较大,完全符合Force基因在拟南芥植株中叶片的生理特性。
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