MicroRNAs(miRNAs)通过抑制靶基因的翻译在肿瘤的发生和发展中发挥重要作用。研究已经发现有多种miRNAs与非小细胞肺癌(non-small-celllungcancer，NSCLS)的发生有密切关系，但是miR-136在NSCLC中的作用目前还不清楚。我们在本研究中发现，miR-136在NSCLC肿瘤组织中的表达显著上调。通过对多种NSCLC细胞株进行检测发现，与正常细胞株相比，NSCLC细胞株中miR-136的表达均有不同程度的增加。抑制NSCLC细胞株A549中miR-136的表达能够抑制该肿瘤细胞的锚定依赖性和非锚定依赖性增殖。同时，我们还发现miR-136促进NSCLC细胞的增殖与胞外信号调节激酶1/2（extracellular-signal-regulatedkinase1/2，Erk1/2）的活化有关。采用anti-miR-136抑制miR-136的表达后Erk1/2的磷酸化水平显著降低。通过信息生物学方法结合荧光素酶报告基因分析的方法我们发现，丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶2A55Kda调节亚基Bα(serine/threonineproteinphosphatase2A55kDaregulatorysubunitBαisoform，PPP2R2A，B55α)是miR-136的一个直接靶基因，抑制miR-136的表达能够显著上调PPP2R2AmRNA和PPP2R2A蛋白的表达水平。在NSCLC细胞中过表达PPP2R2A后miR-136引起的ERK1/2活化受到抑制，同时miR-136引起的细胞增殖也受到抑制。对NSCLC组织进行免疫组化分析的结果也发现，PPP2R2A在NSCLC组织中的表达明显低于正常的癌旁组织。说明，miR-136是通过抑制PPP2R2A的表达促进ERK1/2的磷酸化，总之，本研究发现在NSCLC中，miR-136通过抑制PPP2R2A促进ERK1/2的活化，从而促进细胞的增殖，提示其可能成为临床NSCLC治疗的一个有效靶点。　　第一部分miR-136在NSCLC肿瘤组织及细胞株中的表达　　方法：　　1.采用q-PCR的方法对37对NSCLC肿瘤组织，及其相应的癌旁组织中miR-136的表达情况进行分析。并采用q-PCR方法对NSCLC细胞系A549，SPC-A1，NCI-H1299和正常支气管上皮细胞系16HBE中miR-136的表达进行检测　　2.采用原位杂交的方法检测了miR-136在NSCLC组织中的表达。　　3.统计学处理:应用SPSS13.0软件处理数据，数据用均数±标准差(x±s)，两样本均数比较采用独立样本t检验;两个有序变量之间的相关性检验用Spearman相关分析，两分类变量的比较用Pearsonsx2检验;以α=0.05为检验水准。P＜0.05时有统计学意义。　　结果：　　1.q-PCR和原位杂交的检测结果均显示，与相应的正常组织相比，在NSCLC肿瘤组织中，miR-136的表达显著增加。通过对患者临床病理学特征进行分析发现，miR-136的表达与患者的性别和年龄没有明显的关系，但是，在腺癌中的表达要高于鳞状细胞癌。另外，miR-136的表达水平与肿瘤是否发生淋巴结转移没有明显的关系，但是和肿瘤的分化程度呈负相关。　　2.q-PCR的检测结果显示，与正常支气管上皮细胞株16HBE相比，NSCLC细胞株A549，SPC-A1，NCI-H1650和NCI-H1299中miR-136的表达均有不同程度的上调，其中在A549中的表达增加最为显著。　　第二部分miR-136上调激活Erk1/2促进NSCLC细胞的增殖　　方法：　　1.采用脂质体转染的方法将miRNA抑制剂转染至NSCLC细胞中，抑制miR-136的表达，并采用q-PCR的方法验证抑制效果。　　2.采用MTT分析和软琼脂克隆形成实验检测miR-136对NSCLC细胞的增殖能力的影响。　　3.采用westernblot的方法检测抑制NSCLC中的miR-136对Erk1/2信号通路的影响。　　4.运用免疫组织化学的方法检测NSCLC组织中Erk1/2信号通路的活化情况。　　5.统计学处理:应用SPSS13.0软件处理数据，数据用均数±标准差(x±s)，采用one-wayANOVA与studentst检验各组间差异的显著性，P＜0.05时有统计学意义。　　结果：　　1.与对照组相比，转染了miR-136抑制剂anti-miR-136三天和五天之后，NSCLC细胞中miR-136的量分别下降了75％和64％(P＜0.05)。　　2.MTT分析实验结果显示:抑制NSCLC细胞A549中miR-136的表达量之后，细胞的增殖能力显著下降，与对照组相比，转染了anti-miR-136之后第5天细胞的存活率下降至71％(P＜0.05)。　　3.软琼脂克隆形成实验结果显示:抑制A549细胞中miR-136的表达之后，细胞的克隆形成能力显著下降。与对照组相比，转染了anti-miR-136的细胞形成的克隆数减少了62％(P＜0.05)。　　4.westernblot检测结果显示:抑制A549细胞中miR-136的表达使Erk1/2以剂量依赖的方式降低活性。转染40nM的anti-miR-13672小时后，90％的Erk1/2磷酸化受到抑制。　　5.免疫组织化学检测结果显示:在NSCLC组织中，Erk1/2的磷酸化上调与miR-136的表达上调相一致。与相应的癌旁正常组织相比，NSCLC组织中Erk1/2的磷酸化水平明显增高。　　第三部分miR-136激活Erk1/2促进NSCLC细胞增殖的机制研究　　方法：　　1.利用PicTar和TargetScan软件进行分析预测miR-136的靶基因，并用荧光素酶报告基因分析的方法进行验证。　　2.采用转染结合q-PCR或Westernblot的分别检测miR-136对A549细胞中PPP2R2AmRNA和PPP2R2A蛋白表达的影响。　　3.采用q-PCR和westemblot的方法检测NSCLC组织中PPP2R2AmRNA和PPP2R2A蛋白的表达情况。　　4.结合临床病理资料分析PPP2R2A表达与患者临床病理特征是否有关联。　　5.通过在A549细胞中单独过表达miR-136或者共同过表达PPP2R2A，结合westemblot检测miR-136对Erk1/2的活化是否与PPP2R2A有关。　　6.通过在A549细胞中单独过表达miR-136或者共同过表达PPP2R2A，结合MTT实验检测PPP2R2A是否影响miR-136诱导的细胞增殖。　　7.统计学处理:应用SPSS13.0软件处理数据，数据用均数±标准差(x±s)，采用one-wayANOVA与studentst检验各组间差异的显著性，P＜0.05时有统计学意义。两个有序变量之间的相关性检验用Spearman相关分析，两分类变量的比较用Pearsonsx2检验;以α=0.05为检验水准。P＜0.05时有统计学意义。　　结果：　　1.PicTar和TargetScan软件分析预测:结果发现PPP2R2AmRNA3UTR含有miR-136的可能结合位点，是miR-136的一个重要靶基因。　　2.荧光素酶分析实验:结果发现，与对照miRNA相比，在A549中miR-136能够显著抑制含有野生型-3UTR报告载体的荧光素酶活性，而对含有突变型-3UTR的报告载体的荧光素酶活性没有影响。　　3.q-PCR和westemblot检测:结果显示，抑制miR-136的表达后A549细胞中PPP2R2AmRNA和PPP2R2A蛋白的表达水平均明显增加。　　4.q-PCR和westemblot检测:结果显示，与正常组织相比，在NSCLC组织中PPP2R2AmRNA和PPP2R2A蛋白的表达降低，而且与miR-136的表达呈负相关。　　5.病理学分析:结果提示miR-136表达与患者的年龄，性别及TNM级别没有直接的关联，但是，PPP2R2A与肿瘤的组织学分级有重要关系。　　6.在A549细胞中过表达miR-136，PPP2R2A的表达受到抑制，同时Erk1/2磷酸化水平上调。而共同过表达miR-136和PPP2R2A后，A549细胞中由miR-136诱导的Erk1/2磷酸化受到抑制。　　7.在A549细胞中过表达miR-136，细胞增殖增加32％，而同时过表达miR-136和PPP2R2A后细胞增殖减少了44％。　　结论：　　1.miR-136在NSCLC组织及NSCLC细胞株中表达上调，提示miR-136的高表达与NSCLC的发生有关。　　2.抑制miR-136的表达能够抑制NSCLC细胞的增殖，其作用机制可能与抑制Erk1/2的激活有关。　　3.PPP2R2A是miR-136的靶基因，在NSCLC细胞株A549中抑制miR-136的表达，PPP2R2A的表达显著增加。　　4.过表达miR-136能够促进A549细胞的增殖，而同时过表达PPP2R2A则使miR-136诱导的细胞增殖发生逆转。　　5.miR-136通过抑制PPP2R2A促进Erk1/2的磷酸化，从而促进NSCLC细胞的增殖，可望成为抗NSCLC治疗的潜在分子靶点。