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最初对植物干细胞的定义仅指在植物分生组织中未分化又具有再生能力的细胞,后来朱至清（2003）和Verdeil等人（2007）又引入离体培养物干细胞概念。Verdeil等认为离体培养的胚性细胞包括胚性愈伤组织以及体细胞胚也属于植物干细胞范畴,因此我们认为植物胚性愈伤组织以及体细胞胚属于干细胞的一种存在形式,并且WUSCHEL（WUS）基因是诱导植物体胚发生的重要因子,被认为是启动植物体胚发生的基因。于是本研究以龙眼胚性愈伤组织以及体胚发育不同阶段的胚性培养物为材料,在龙眼转录组数据（GenBank登录号为SRA059205）基础上,利用RT-PCR以及RACE技术克隆获得WUS-CLV负反馈调节环相关基因,包括WUS、CLAVATA1（CLV1）、CLAVATA2（CLV2）以及CORYNE（CRN）4个基因,并通过一系列相关的生物信息学、亚细胞定位、实时荧光定量PCR、转化龙眼胚性愈伤组织的瞬时表达分析以及原位转化沙田柚幼苗,对这4个基因进行初步的功能验证,为研究龙眼体细胞胚胎发育的分子机制提供参考价值。本研究获得的主要结果如下:1龙眼胚性培养物WUS、CLV1、CLV2以及CRN基因的克隆与生物信息学分析以龙眼胚性愈伤组织以及不同体胚阶段的胚性培养物为材料,基于龙眼转录组数据分析,利用RT-PCR以及RACE技术克隆获得5条基因,其中CLV1包括2个成员,分别命名为:DlWUS（GenBank 登录号为 KM017506）、DlCLV1-1（GenBank 登录号为 KU140428）、DlCLV1-2（GenBank 登录号为 KU140429）、DlCLV2（GenBank 登录号为 KM410158）与 DlCRN（GenBank登录号为KU140430）。生物信息学分析结果表明:DlWUS属于WOX转录因子家族,具备WUS的保守结构域HOX、WUS box以及EAR-like,不含有跨膜结构域也不属于分泌蛋白;DlCLV1-1与DlCLV1-2属于LRR-RLKs家族,具备该家族的典型结构特征,即DlCLV1-1由包含19个完整亮氨酸重复序列的胞外域、单次跨膜结构域以及一个胞内激酶域组成,而DlCLV1-2由包含17个完整亮氨酸重复序列的胞外域、单次跨膜结构域以及一个胞内激酶域组成;DlCLV2属于LRR-RLPs家族,具备该家族的典型结构特征,即DlCLV2由包含20个完整亮氨酸重复序列的胞外域、单次跨膜结构域以及一个由12个氨基酸组成的胞内短尾结构组成;DlCRN属于膜受体蛋白,具备跨膜结构域,并且含有一个胞外激酶域。为了了解这5个基因在植物进化中的亲缘关系,分别对它们构建进化树,结果发现除了DlCLV1-2,其它4个蛋白均与柑橘属的脐橙亲缘关系最近,而DlCLV1-2则与蓖麻亲缘关系最为密切并偏向于单子叶植物。2 DlWUS、DlCLV1-1、DlCLV1-2、DlCLV2以及DlCRN蛋白的亚细胞定位分析在获得DlWUS、DlCLV1-1、DlCLV1-2、DlCLV2以及 DlCRN cDNA 全长序列的基础上,构建融合绿色荧光GFP蛋白的表达载体并通过农杆菌介导法将其在洋葱内表皮细胞中异位表达,观察蛋白定位情况。结果表明:DlWUS定位于细胞核,与分析软件预测结果相符,符合其转录因子身份的特征;DlCLV1-1、DlCLV1-2、DlCLV2以及DlCRN均定位于质膜,与分析软件预测结果一致,都属于膜定位蛋白,参与细胞间信号的转导。3DlWUS、DlCLV1-1、DlCLV1-2、DlCLV2以及DlCRN在龙眼活体器官、体胚发生过程以及胚性愈伤组织发育过程中的表达分析以龙眼活体组织,体胚发育不同阶段的胚性培养物以及胚性愈伤组织同一周期不同培养天数的培养物为试验材料,利用实时荧光定量PCR检测DlWUS、DlCLV1-1、DlCLV1-2、DlCLV2以及DlCRN的转录水平。结果表明:DlWUS主要在花蕾中表达,而其他4个基因均在根中有较强的表达,另外DlCLV1-2与DlCL V2在果肉中还有很高的表达,说明DlWUS参与龙眼花早中期的发育,但不参与根的发育,而DlCLV1-1、DlCL V1-2、DlCLV2、DlCRN对龙眼根发育具有调控作用;在非胚性愈伤组织中5个基因均有较高的表达,但在体胚发育过程中5个基因呈现不同的表达规律:DlWUS、DlCLV1-2、DlCL V2、DlCRN均在体胚发育中后期有较高的表达,而DlCLV1-1则是在胚胎发育的早期有较高的表达,说明WUS-CLV对胚胎后期形态建成有一定的影响;功能上具有加速细胞分裂以及促使干细胞形成及维持的DlWUS主要在胚性愈伤组织快速生长期大量表达;诱导干细胞分化的DlCLV1-1、DlCL V2与DlCRN则是在胚性愈伤组织进入老化时期大量表达。4外源生长素与细胞分裂素对龙眼胚性愈伤组织DlWUS、DlCLV1-1、DlCLV1-2、DlCLV2以及DlCRN表达的影响以龙眼胚性愈伤组织为材料,经IAA、NPA、PP333、KT以及IAA+KT处理后检测DlWUS、DlCLV1-1、DlCLV1-2、DlCLV2 以及 DlCRN的表达量,结果表明:IAA 处理后 DlWUS、DlCLV1-1、DlCLV1-2与DlCLV2的表达量均上调而DlCRN的表达下调,说明外源生长素影响龙眼WUS-CLV基因的表达;NPA处理后龙眼胚性愈伤组织内源生长素极性运输受到破坏,DlWUS表达量大幅度下调,而DlCLV1-1、DlCLV1-2上调表达,说明生长素的极性运输诱导 DlWUS 的表达抑制 DlCLV1的表达;PP333 处理后 DlWUS、DlCLV1-1、DlCLV1-2 与DlCLV2的表达均受到一定程度的抑制,而DlCRN的表达量则上调,这可能是由于PP333处理后导致龙眼胚性愈伤组织内源生长素累积浓度下降;KT处理后DlWUS、DlCLV1-2、DlCLV2、DlCRN表达量上调,而DlCLV1-1的表达量下调,说明外源细胞分裂素影响龙眼WUS-CLV基因的表达;IAA与KT共同处理后DlWUS表达量相较于单激素处理大幅度上调表达,而其他4个基因则都表现为表达受到抑制,并且抑制效果不低于单激素处理时的效果,说明外源生长素与细胞分裂素配合使用更有利于干细胞的形成与维持。5 DlWUS转化龙眼胚性愈伤组织的瞬时表达分析根据快切酶体系构建pCAMBIA1301-DlWUS植物表达载体并利用农杆菌介导法将其转入龙眼胚性愈伤组织中,利用GUS报告基因检测转化效率,在此基础上利用实时荧光定量PCR检测过表达DlWUS后DlCLV1-1、DlCLV1-2、DlCLV2、DlCRN等4个基因表达水平的改变,结果表明:过表达DlWUS导致DlCLV1-1、DlCLV1-2、DlCL V2、DlCRN的表达均受到不同程度的抑制,其中以DlCL V1-1与DlCLV1-2受到的影响最为显著,通过实时荧光定量PCR几乎检测不到它们的表达。由此我们初步得出结论:在龙眼中,DlWUS的表达对DlCLV1-1、DlCLV1-2、DlCL V2、DlCRN具有抑制作用,以此削弱WUS与CLV间的负反馈调节作用,并且在这一负反馈调节环中以DlWUS与DlCLV1-1互作关系最为亲密。6 DlWUS基因转化沙田柚幼苗由于龙眼遗传转化的困难,本试验选择在亲缘关系上与DlWUS最近的柑橘为受体材料。利用现有的柑橘原位转化体系将龙眼DlWUS基因转化沙田柚幼苗,通过PCR检测确认得到4株阳性植株,并通过实时荧光定量PCR检测异位表达DlWUS后沙田柚自身WUS、CLV1、CLV2、CRN基因的表达量以及抗病相关基因PR2、PR3、PR5、POX、LOX2表达量的变化。结果表明:异位表达DlWUS后导致沙田柚自身WUS、CLV1、CLV2、CRN基因表达量下调,抗病基因PR2、PR3、PR5、POX、LOX2上调表达,进一步验证在木本植物中WUS的过表达能够抑制WUS-CLV负反馈调节环中受体蛋白的表达,以此削弱WUS与CLV间的负反馈调节作用,另外我们还发现WUS的表达影响植物抗病基因的表达,可能对提高植物抗病能力具有积极作用。综上所述,本研究克隆获得5条WUS-CLV负反馈调节环中参与作用基因的cDNA全长序列,即 DlWUS、DlCLV1-1、DlCLV1-2、DlCLV2 和 DlCRN;亚细胞定位分析表明除了 DlWUS定位于细胞核其他4个蛋白均定位于细胞膜,属于膜定位蛋白;它们在龙眼的活体器官中都呈现组织特异性表达,参与胚胎发育中后期形态的建成,同时对生长素以及细胞分裂素均有响应。总体上DlWUS与其他几个基因的表达规律相反,表现为相互调控;在龙眼胚性愈伤组织中当DlWUS过表达后DlCLV1-1、DlCLV1-2、DlCLV2和DlCRN的表达受到抑制,这一现象同样存在于成功转入DlWUS的沙田柚中,说明在WUS-CLV负反馈调节环中,WUS的表达可以抑制CLV1、CLV2和CRN等受体蛋白的表达以此削弱WUS与CLV间的负反馈调节作用。异位表达DlWUS后有效提高了柑橘抗病基因PR2、PR3、PR5、POX、LOX2的表达,说明WUS的表达可能对提高植物抗病能力有一定的积极作用。