龙眼(Dimocarpus longanLour.)是无患子科(Sapindaceae)常绿木本果树,是我国南亚热带名贵特产,历史上有南方“桂圆”北“人参”之称。龙眼种子(胚胎)等发育情况与龙眼果实产量品质密切相关。越来越多证据表明植物体胚发生过程中基因表达的时空特异性不仅由特异的DNA序列控制,还受表观遗传调控,其中最重要的修饰之一就是DNA甲基化,一定程度的DNA甲基化有利于植物体胚的正常发育。近年的研究报道表明,miRNA,特别是24nt的1miRNA与DNA甲基化密切相关。然而,目前关于龙眼体胚发生过程中1miRNA介导靶基因甲基化机制研究较少,并且其合成途径中Dicer-like蛋白(DCL蛋白)在龙眼体胚发生中的功能特异性以及响应外界环境作用机制尚不明确。本课题组前期研究表明,miRNA在龙眼体胚发生中具有重要作用,而mmiRNA的产生依赖于DCL酶的切割,提示DCL在龙眼体胚中同样起着调控作用。鉴于此,本研究以龙眼胚性愈伤组织的转录组数据为基础,对龙眼胚性愈伤组织DlDCLs基因家族成员进行克隆和生物信息学分析;以龙眼基因组数据为参考,对DlDCLs进行启动子克隆和顺式作用元件分析;利用qPCR技术,对DlDCLs在龙眼体胚不同发育阶段、不同组织部位、不同激素和非生物胁迫处理以及DNA甲基抑制剂处理下的基因表达模式进行研究;利用反义寡核苷酸沉默技术研究抑制DlDCL3和DlDCL4后对龙眼体胚发生早期进程的影响;为揭示DlDCLs在龙眼体胚发生过程中的调控机制和功能提供科学依据。主要研究结果如下:1龙眼体胚发生过程中DlDCLs的克隆与生物信息学分析以龙眼胚性愈伤组织转录组数据库(GenBank登录号:SRA059205)为基础,对其进行筛选发现龙眼转录组数据存在DlDCL1、DlDCL2、DlDCL3和DlDCL4四个基因家族成员,且基于Unigene的FPKM值发现不同基因在体胚发生阶段具有差异表达,对其中表达水平较高的Unigene8573、Unigene22241、Unigene19574 和 CL2379.Contig2 成员的开放阅读框(ORF)进行克隆,GeneBank登录号分别为MF001060、MF001061、MF001062和MF001063。序列比对分析发现4个成员氨基酸序列之间同源性与相似性普遍较低,且核苷酸和编码氨基酸长度差异较大,表明DlDCLs成员之间在进化上存在明显区别。生物信息学分析表明,DlDCLs成员间基本理化性质较为类似,均为亲水性不稳定蛋白、不含信号肽、可进行跨膜运动,但也存在一定差异,如DlDCL2为碱性蛋白,而其他3个成员为酸性蛋白;亚细胞定位预测显示,DlDCLs均定位于细胞核中,但DlDCL2也存在定位于叶绿体的可能;对不同物种DCL蛋白结构域进行预测,结果显示DCL是高度保守的蛋白。系统进化树分析显示,不同物种的DCL分为4个分支,同源的DCL蛋白都聚为一类,且DlDCLs与柑橘DCL亲缘关系更为接近。2龙眼DlDCLs基因启动子克隆与顺式元件分析采用直接PCR法对龙眼基因组数据提取的DlDCL1、DlDCL2、DlDCL3和DlDCL4基因5’端调控序列进行克隆验证,获得了 4条大小分别为2974、2687、2702和2829bp的5’端调控序列。启动子顺式作用元件分析表明,龙眼DlDCLs基因启动子中除了 TATA和CAAT外,还具有大量的光反应元件、激素应答元件、胁迫响应元件、组织特异性调控元件及植物生长发育相关的顺式调控元件,提示龙眼DlDCLs基因启动子转录活性可能受到光、激素信号及逆境胁迫因素的诱导。进一步对DlDCLs基因家族不同成员启动子顺式元件的比较分析表明,不同成员的启动子间除了各自含有特异的顺式元件外,还具有一些共有的顺式元件及响应同一胁迫的不同顺式元件。说明在一定程度上,同一胁迫可调控多个成员的表达,但各个成员在响应同一胁迫上又具有一定的差异性。3龙眼DlDCLs基因在龙眼’红核子’体胚不同发育阶段和不同组织部位表达模式分析qPCR分析龙眼DlDCLs在体胚不同发育阶段的表达模式,结果表明DlDCLs在龙眼非胚性愈伤组织和体胚发生过程中的表达模式差异较大,但DlDCLs在胚性愈伤组织阶段均有较高的表达量,推测DlDCLs在体胚发生过程可能具有功能的独立和协作。qPCR分析龙眼DlDCLs在不同组织部位的表达模式,结果表明DlDCL1和DlDCL2在叶片、花器官等组织部位中的相对表达量较高,DlDCL3、DlDCL4在各个组织部位中的表达量均较低,暗示DlDCL1和DlDCL2可能参与到光合作用和花器官的发育。4龙眼胚性愈伤组织在激素和非生物胁迫下DlDCLs表达模式分析qPCR分析龙眼胚性愈伤组织在2,4-D、MeJA、SA、GA3、ABA和ETH 6种激素处理下DlDCLs基因的表达模式,结果表明在一定浓度范围内,2,4-D处理下DlDCLs转录水平变化呈先上升后下降,在2,4-D浓度为0.5 mg/L处理时基因表达量上调,2.0 mg/L处理时转录表达量下调;在一定浓度范围内,MeJA、SA、GA3、和ABA处理均能下调DlDCLs基因的表达,而高浓度ETH处理则显著上调DlDCLs的表达。qPCR分析龙眼胚性愈伤组织在光质、蔗糖、温度和NaCl胁迫下DlDCLs的基因表达模式,结果表明:DlDCL/、DlDCL3、DlDCL4在不同光质处理下相对表达均上调,而DlDCL2则在红光、蓝光、混合光处理下相对表达显著上调,预示DlDCLs可能受到光质诱导。蔗糖胁迫下,高浓度蔗糖(6%)处理时,DlDCL2、DlDCL3和DlDCL4基因显著上调表达;而低浓度(0.1%)处理时DlDCL1显著上调表达。不同温度处理下,DlDCL1在34℃时显著上升,DlDCL3随温度的提高相对表达量逐渐减低;而DlDCL2和DlDCL4表达量差异不明显。NaCl胁迫处理下,DlDCIs在1h处理时表达量下调,但在其他不同时间点则上调表达。上述结果可以得出:龙眼DlDCLs基因在外源激素及非生物胁迫处理下,并非是简单的一对一响应,而是存在较为复杂的响应机制。5 5-氮胞苷(5-azaC)对龙眼胚性愈伤组织细胞和DlDCLs表达的影响龙眼胚性愈伤组织在添加0、1.0、1.5、2.0和2.5μM5-azaC固体培养基中培养20d后,分别对其生长量和细胞形态进行观察,结果发现:与对照相比,高浓度5-azaC(l 0μM、1.5μM、2.0μM和2.5μM)处理的龙眼胚性愈伤组织生长量明显变少,而低浓度5-azaC(0.5μM)处理时生长量略微增加。显微观察结果显示:0.5μM5-azaC处理的龙眼胚性愈伤组织细胞与CK细胞状态无明显差异,结构松散,大部分细胞呈圆形或卵圆形,且细胞质较浓,细胞内有明显的细胞器结构及其他物质。1.0μM、1.5μM和2.0μM5-azaC处理的龙眼胚性愈伤组织细胞大小不一且呈圆形、椭圆形等。2.5μM5-azaC处理的龙眼胚性愈伤组织细胞出现大量碎片,胞膜破裂,细胞内容物外溢。由于5-azaC对细胞具有一定的毒害作用,因此选择合适的作用浓度与作用时间尤为重要。为进一步分析DlDCLs基因在5-azaC处理下的转录情况,本试验选用 0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9和1.0μM 5-azaC对悬浮培养的龙眼EC处理24h。结果显示,在一定浓度范围内5-azaC处理对DlDCL3和DlDCL4具有一定下调作用,而DlDCL1和DlDCL2分别在0.3和0.5μM 5-azaC处理时出现了最高的表达量,提示DlDCLs参与5-azaC的响应,且不同成员表达模式存在一定的差异性。6龙眼DlDCL3和DlDCL4基因沉默对体胚发生早期的影响根据龙眼DlDCL3和DlDCL4基因序列设计并合成用于敲除靶基因的反义寡核苷酸(siRNA),随后将一定浓度的siRNA导入龙眼胚性愈伤组织中,并利用qPCR检测RNAi沉默效果。结果显示,DlDCL3-siRNA-2801 和 DlDCL4-siRNA-590 抑制效果最佳。将经 siRNA处理的胚性愈伤组织转移到MS和MS+0.1mg/L2,4-D上,利用显微观察技术鉴定DlDCL3和DlDCCL4沉默后对龙眼体胚发生早期形态建成的影响,试验结果表明抑制DlDCL3基因的表达,在一定程度上加快了龙眼体胚发育进程。而抑制DlDCL4基因的表达对龙眼体胚发育和分化速度能力有一定的减弱作用。但随着时间的推移,处理组与对照组在体胚发育早期进行上逐渐趋于同步。推测,抑制DlDCL3或DIDCL4基因表达,其他成员可以替代并发挥它们在体胚分化过程中的作用。