目的:观察缺氧对软骨细胞体外培养时的失分化过程的影响,并探究胶原蛋白脯氨酰4-羟化酶(C-P4Hs)和缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)在其中的作用。方法:将第3代小鼠肋软骨细胞分别在不同浓度Cocl2条件下组分别培养72h,筛选最佳浓度的Cocl2缺氧诱导模型。取第3代小鼠肋软骨细胞分为:常氧组、缺氧组,分别取第3代肋软骨细胞于不同时间段(6、12、24、48、72h)及1、3、5、7代肋软骨细胞于72h使用CCK8法及细胞计数仪测定细胞增殖率,使用荧光定量PCR、免疫荧光染色、Western blot检测各组HIF-1α、P4Hα1、P4Hα2和Col-II随培养时间及代数的动态变化。结果:1.软骨细胞分别在不同浓度Cocl2条件下分别培养72h后,100μM/L Cocl2组在培养72h时细胞增殖率最高,细胞呈典型的多角形和铺路石状;当Cocl2浓度>150μM/L时,细胞增殖率(P<0.05)显著降低。2.常氧与缺氧下诱导软骨细胞0-72h后,RT-q PCR结果显示缺氧组P4Hα2及Col-II m RNA较常氧组表达显著升高(P<0.05)。免疫荧光结果显示HIF-1α与P4Hα2主要累积于胞核内,缺氧下P4Hα2逐渐由胞核进入胞浆中,P4Hα1主要分布于胞浆中,Col-II分布于全细胞中。Western-blot结果显示,缺氧组HIF-1α、P4Hα2蛋白(P<0.05)表达显著高于常氧组。缺氧组Col-II蛋白(P<0.05)在诱导后期高于常氧组。3.常氧与缺氧下培养软骨细胞1-7代后,CCK8与细胞计数结果显示缺氧组各代细胞的增值率及细胞数均显著高于常氧组(P<0.01),且传至6-7代时仍有进一步增殖的潜力。RT-q PCR显示缺氧组各代细胞的P4Hα2、Col-II m RNA表达均显著高于常氧组(P<0.01)。Western-blot显示,缺氧组HIF-1α、P4Hα2、Col-II蛋白(P<0.05)各代表达均高于常氧组。结论:1.当体外培养软骨细胞的Cocl2浓度为100μM/L时,可促进软骨细胞增殖,并明显延缓细胞的失分化过程。当Cocl2浓度大于150μM/L时可对细胞产生明显的药物毒性作用,因此体外培养软骨细胞时的最佳氯化钴浓度为100μM/L。2.氯化钴可通过化学缺氧诱导软骨细胞高表达HIF-1α,从而使P4Hα2表达增高。可加速Col-II在细胞内的翻译后修饰过程,增加Col-II的合成和累积。3.P4Hα2是C-P4Hs在软骨细胞中的主要成分,而P4Hα1是次要成分,P4Hα2在软骨细胞中接受HIF-1α的调控。4.缺氧条件下体外培养软骨细胞增殖率增高、失分化过程延缓可能与P4Hα2有关。