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猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea，PED)是猪流行性腹泻病毒(porcineepidemic diarrhea virus，PEDV)引起的一种以腹泻、呕吐和脱水为主要临床特征的高度接触性传染病。PED可引起所有年龄段的猪的急性肠炎，尤其是哺乳母猪，给世界各国养猪业带来了极大的危害。目前该病的预防主要采用灭活或弱毒疫苗。实践证明，血清IgG、IgM对PED的免疫保护效果不理想，肠道粘膜免疫所产生的分泌型抗体(sIgA)是抵抗PEDV感染的有效抗体。本研究主要探讨PEDV抗原表位COE基因在肠道特异表达，以期得到一种能在猪肠道特异表达且能刺激肠道长生特异性抗体的DAN疫苗。 本研究克隆了小鼠的小肽转运蛋白(PepT1)5’端调控序列(Pe序列)1.1kb，将之取代载体pVAX1上的CMV启动子，将绿色荧光蛋白基因(GFP)分别插入克隆的调控序列和CMV启动子下游，构建了重组载体Pe-GFP/pVAX1-GFP。用绿色荧光蛋白报告基因来检测小肽转运蛋白5’端调控序列的活性和特异性。之后将COE基因替换GFP，构建肠道特异表达载体Pe-COE，以及非定位表达载体pVAX1-COE。 将上述多种重组载体分别转染CHO细胞和SW480细胞，经体外培养后，荧光显微镜观察Pe-GFP/pVAX1-GFP载体的绿色荧光蛋白在SW480细胞中均获得表达，在CHO细胞中只有非定位表达载体获得表达，且由Pe调控序列驱动的表达水平略低于CMV驱动的表达水平。Western Blot检测Pe-COE/pVAX1-COE重组载体的PEDV的部分S蛋白(即COE基因编码的蛋白)在SW480细胞中均获得表达，在CHO细胞中只有非定位表达载体获得表达，蛋白大小约为20kD。由Pe调控序列驱动的表达相对CMV驱动的表达水平较低。 为了能真实反映在体内外源基因的表达以及被调控的状况，本研究采用脂质体包裹，经肌肉注射的方法将重组质粒导入小鼠体内，使表达载体经肌细胞吸收后表达。在注射1周后宰杀小鼠，取各内脏器官做冰冻切片，经冰冻切片免疫荧光检测，证明Pe调控序列驱动的重组载体能在肠道上皮细胞中表达，而在其他组织，如肝、肾、肌肉中均无表达或表达量很少。 用纯化的质粒免疫小鼠，共3组，分别为PBS组，pVAX1-COE组和Pe-COE组于4周龄进行首次免疫，首免后第10d和第20d分别加强免疫一次，首免前第0d，首免后的第10d、20d、30d、40d、50d对免疫小鼠进行采血，分离血清，采用ELISA方法检测血清中特异性抗体的水平，在免疫后的第10天到第50天，实验组(pVAX1-COE质粒组和Pe-COE质粒组)抗体水平高于PBS组(P<0.01)。第40天后实验组抗体水平持续上升，pVAX1-COE质粒组高于Pe-COE质粒(P<0.01)。以及采集肠粘液，用ELISA方法检测肠粘液中的特异性sIgA的抗体水平，在免疫后10天，实验组与PBS组的抗体未出现明显变化，到第20天pVAX1-COE质粒组的抗体水平明显高于PBS组(P<0.01)，略高于Pe-COE质粒组(P<0.05)，Pe-COE质粒组的抗体水平也开始高于PBS组(P<0.05)。到第30天，Pe-COE质粒组的抗体水平已经明显高于PBS组(P<0.01)，但是pVAX1-COE质粒组的抗体水平仍然高于Pe-COE质粒组(P<0.01)，第40天和第50天，Pe-COE质粒组与pVAX1-COE质粒组的差异不显著。 结果表明，本研究构建的肠道特异表达载体能够使猪流行腹泻病毒抗原基因在肠道表达并具有一定的免疫原性，为新型DNA疫苗的研究提供了新的思路，为制备新型猪流行性腹泻病毒疫苗提供了一定的理论基础。