内生真菌(endophytic fungi)是指在其整个或部分生活史中存在于健康植物组织和器官内部,对宿主没有明显病害的真菌。已有研究表明内生真菌可以产生与宿主植物相同或相似的生物活性成分,并对宿主植物的生长和代谢产物的积累有促进作用。连翘Forsythia suspensa(Thunb.)Vahl为多年生落叶灌木,在我国山西、陕西、河南等地都有分布。连翘苷是连翘的主要活性成分,药典中定为中药连翘的质量控制指标。据报道连翘苷有抗氧化、抗炎、抗高血脂、清热等多种生物学活性,临床主要用于温热、疮疡、丹毒、班疹的治疗。在实验室的前期研究中,从连翘中分离筛选到一株可产连翘苷的内生真菌G10,经鉴定为炭疽菌属真菌胶孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides,但产量较低。本文对G10进行了诱变选育,并对其培养基进行了优化研究,以期获得高产菌株。研究结果如下:(1)利用紫外分光光度计对菌株G10所含的连翘苷进行了初步检测,初始产量为5.09 mg/g。利用紫外线、亚硝酸钠和紫外线结合亚硝酸钠三种方法对菌株G10的孢子悬液进行诱变。结果显示,三种方法均可得到正向突变菌株,三种方法分别得到不同高产的突变菌株为:UV2.5-2、Na5-1和S1.5-2。其中紫外线结合亚硝酸钠诱变效率较高,经过该方法处理的菌株连翘苷产量亦相对较高。经分析较合适的复合诱变条件为:紫外线照射(15 W,30 cm距离)2 min,亚硝酸钠终浓度30g/L。将复合诱变得到的高产菌株S1.5-2和出发菌株G10摇瓶发酵培养,紫外分光光度计检测连翘苷产量,高产突变株S1.5-2的产量为12.62 mg/g,是出发菌株G10产量5.09 mg/g的2.48倍;HPLC检测,高产突变株S1.5-2的连翘苷产量为0.79±0.22mg/g,是出发菌株0.36±0.34mg/g的2.19倍。经传代培养检测,S1.5-2菌株具有较好的遗传稳定性。(2)通过形态学观察结合分子生物学方法,对诱变得到的三株高产菌株UV 2.5-2、Na 5-1和S1.5-2进行鉴定,三株菌均属于炭疽菌属真菌胶孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides。(3)对原始菌株G10和三个诱变菌株的RAPD图谱进行聚类分析,发现4个菌株分别聚成了 2个大的分支,诱变菌株Na5-1和S1.5-2聚成了一个独立的分支,说明这两株菌之间的相似关系相对于其他菌株近,而与原始菌株G10的距离较远。这四株菌的相似系数在0.37到0.67之间变动,诱变菌株UV2.5-2离原始菌株G10的距离最近,它们之间的遗传相似系数是0.67。RAPD及聚类分析说明了诱变使得原始菌株与诱变菌株之间的遗传物质发生了变化,从而产生了菌株的遗传多样性。(4)通过比较菌株S1.5-2在基础培养基(PDA培养基、豆芽汁培养基和查氏培养基)中的菌丝体干重与连翘苷产量,发现豆芽汁培养基对菌丝体生长和连翘苷含量的积累都非常有利。在发酵培养第8 d时,豆芽汁培养基中的菌丝体干重达到最大,为0.72 g,是PDA培养基的1.2倍;在发酵培养第8 d时,豆芽汁培养基中连翘苷产量达到最大值,为13.5 mg/g,是PDA培养基的1.08倍。利用单因素分析优化菌株S1.5-2的培养基组成,确定其最适C源、N源,分别是葡萄糖和酵母膏。采用正交优化实验得到菌株S1.5-2的最佳培养基组成为:葡萄糖的浓度为6%,酵母膏的浓度为0.25%,pH为7.0。