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蛇毒类凝血酶(Snake venom thrombin-like enzyme,SVTLEs),属于胰蛋白酶家族中的丝氨酸蛋白酶,主要存在于蝰科蝮亚科蛇的蛇毒中。它在体外能够直接作用于纤维蛋白原,催化纤维蛋白原分子的特定部位Arg-Gly肽键的裂解,释放血纤肽,从而导致纤维蛋白的单体首尾聚合形成凝块;但在体内不激活凝血因子,由它水解生成的纤维蛋白凝块不产生侧链交联,很容易被天然网状内皮系统或正常的纤溶作用所清除,表现降纤、抗凝的效果。临床上,蛇毒类凝血酶已成为防治血栓栓塞性疾病的有效药物,但是由于蛇毒资源有限、分离纯化成本高,难以保证产量,因此利用基因工程手段获得重组蛇毒类凝血酶是满足需求的有效途径。巴斯德毕赤酵母表达系统作为一种成熟的真核表达系统,已经成功表达了多种蛋白,许多蛇毒类凝血酶也已经在毕赤酵母中得到了表达,但是关于中介蝮蛇毒类凝血酶在毕赤酵母中表达的报道却很少。因此,本研究以来自中介蝮毒腺cDNA文库的两个类凝血酶基因为材料,将密码子优化,并突变掉2个Kex2位点,然后采用毕赤酵母GS115菌株进行基因工程表达,对其活性进行分析,有望为该酶的进一步研究奠定基础。本研究的内容:1.对本实验室前期建立的中介蝮毒腺cDNA文库中的两个类凝血酶基因序列进行初步的生物信息学分析。并根据分析结果将其命名为Intobin1和Intobin2。2.根据毕赤酵母密码子偏爱性对Intobin1和Intobin2基因进行密码子优化;为避免毕赤酵母分泌的Kex2蛋白酶对发酵液中所表达的目的蛋白的降解,将Intobin1和Intobin2基因编码的氨基酸中的Arg突变为Lys;同时在Intobin1和Intobin2序列的C末端引入6个His标签,方便后期目的蛋白的纯化。将优化后的Intobin1和Intobin2基因序列送至南京金斯瑞生物科技有限公司全序列合成,并将优化后的突变型(Mutant)基因 Intobin1 命名为 mIntobin1,突变型(Mutant)基因 Intobin2命名为 mIntobin2。3.将突变型基因mIntobin1和mIntobin2克隆于分泌型表达载体pPIC9K,构建重组载体 pPIC9K/mIntobin1 和 pPIC9K/mIntobin2。4.将线性化的重组载体pPIC9K/mIntobin1和pPIC9K/mIntobin2电转入毕赤酵母GS115菌株中,并通过不同浓度的抗生素G418和MD平板筛选阳性克隆;利用试剂盒法提取重组后的 GS115/pPIC9K/mIntobin1 和 GS115/pPIC9K/mlntobin2 的基因组,并用PCR法验证其表型;鉴定正确的阳性克隆进行初步诱导表达,诱导产物用SDS-PAGE和Western-blot进行分析。5.采用单因素实验方法,从诱导时间、甲醇浓度、温度、pH值、抗氧化剂五个方面对诱导表达菌株进行发酵条件优化。以最优的发酵条件进行大规模诱导表达,并采用Ni-NTA纯化柱对目的蛋白进行纯化。6.采用Bradford法计算优化后诱导上清的总蛋白浓度以及纯化后mIntobin1和mIntobin2蛋白的浓度,并采用Gel-Pro软件分析纯化后mIntobin1和mIntobin2蛋白的纯度。7.对纯化后的重组蛋白mIntobin1和mIntobin2进行生物学活性测定。利用BApNA测定mIntobin1和mIntobin2的酰胺水解活性;利用纤维蛋白平板法测定其纤溶活性;采用SDS-PAGE法测定其纤维蛋白原水解活性。实验结果:1.对Intobin1和Intobin2基因序列进行生物信息学分析。结果表明Intobin1基因包含一个长度为789 bp的开放阅读框,编码262个氨基酸,信号肽为1～18位氨基酸(MVLIKVLANLLILQLSYA);成熟肽分子量为26.9kDa,理论等电点为6.76;活性位点为His67、Asp112、Ser208;N-糖基化位点为105位和124位;Intobin1编码的氨基酸序列与Pallabin-2(Gloydius halys,Q9YG16.1)的同源性最高(达94%)。Intobin2基因包含一个长度为783 bp的开放阅读框,编码260个氨基酸,信号肽为1～18位氨基酸(MVLIRVLANLLILQLSYA);成熟肽分子量为26.55 kDa,理论等电点为8.43;活性位点为His67、Asp112、Ser208;N-糖基化位点为123和124 位;Intobin2 编码的氨基酸序列与 Gloshedobin(Gloydius Shedaoensis P0C5B4.2)的同源性最高(达99%)。2.密码子优化结果表明,优化后的Intobin1和Intobin2基因的氨基酸序列与原基因的氨基酸序列一致,优化后Intobin1基因编码的氨基酸中有18个氨基酸的密码子进行了替换,共计72个位点,GC含量由45.61%调整到42.89%。优化后Intobin2基因编码的氨基酸中有17个氨基酸的密码子进行了替换,共计100个位点,GC含量由47.23%调整到43.71%。为防止Kex2对目的蛋白的降解,将Intobin1基因编码的氨基酸中的第138位的Arg突变为Lys,Intobin2基因编码的氨基酸中的第26、48位的Arg突变为Lys。3.优化后的基因克隆于分泌型表达载体pPIC9K,经PCR验证、测序鉴定表明重组载体 pPIC9K/mIntobin1 和 pPIC9K/mIntobin2 已构建成功。4.利用电穿孔仪将线性化的表达载体pPIC9K/mIntobin1和pPIC9K/mIntobin2电转入毕赤酵母GS115中,获得了重组的转化子;通过不同G418浓度的YPD平板筛选,获得了高抗性转化子;MM和MD平板筛选结果表明转化子全为甲醇快速利用型(Mut+);PCR 结果表明 pPIC9K/mIntobin1 和 pPIC9K/mIntobin2 已成功整合入GS115的基因组中;初步诱导表达的上清经SDS-PAGE和Western-blot分析,表明重组蛋白mIntobin1和mIntobin2已获得表达,分子量约为35.0 kDa。5.优化 GS115/pPIC9K/mIntobin1 和 GS115/pPIC9K/mIntobin2 在毕赤酵母中的发酵条件,得到了最佳的诱导表达条件。GS115/pPIC9K/mIntobin1的最佳表达条件为:诱导时间为120 h、甲醇浓度为1%、温度为30℃、pH为6.0,添加褪黑素和抗坏血酸能提高mIntobin1蛋白在毕赤酵母中的表达;GS115/pPIC9K/mIntobin2的最佳表达条件为:诱导时间为96h、甲醇浓度为1%、温度为28℃、pH为6.0,添加抗氧化剂褪黑素和抗坏血酸可以提高mIntobin1在毕赤酵母中的表达。经Ni-NTA柱纯化,在分子量为35.0 kDa处得到了 mIntobin1和mIntobin2蛋白的单一条带。6.按优化后得到的最佳诱导条件进行诱导,结果表明优化后GS115/pPIC9K/mIntobin1 诱导的上清总蛋白含量为 265 μg/ml,GS115/pPIC9K/mInt-bin2诱导的上清总蛋白含量为225 μg/ml,与未优化时的初步表达相比,分别提高了 48.5%和47.3%。纯化后mIntobin1和mIntobin2蛋白的浓度分别为75μg/ml和60μg/ml,与未突变的Intobin1和Intobin2(纯化后)的含量相比无明显变化。Gel-Pro软件分析发现,纯化后mIntobin1的纯度达到80%,mIntobin2的纯度达到70%。7.对纯化后的mIntobin1和mIntobin2蛋白进行相关生物活性鉴定,结果表明mIntobin1和mIntobin2不具有酰胺水解活性和纤溶活性,但具有纤维蛋白原水解活性,mIntobin1从2 h起对牛纤维蛋白原的Aα和Bβ链有微弱的水解作用,将Aα和Bβ链降解成小的片段;而mIntobin2与牛纤维蛋白原保温30 min时,水解牛纤维蛋白原的Bβ链,将Bβ链降解成小的片段,并且随着保温时间的延长水解作用明显加强;但mIntobin1和mIntobin2对牛纤维蛋白原的γ链均没有水解作用。结论:本研究通过一系列实验方法,确立了有效表达mIntobin1和mIntobin2基因的体系,为mIntobin1和mIntobin2基因的深入研究奠定了一定的基础。