论文部分内容阅读
背景:呼吸道合胞病毒(RSV)是引起婴幼儿的下呼吸道感染并导致住院的主要原因之一,也是哮喘发生的危险因素之一。E3泛素连接酶Cbl-b已被证明参与调节先天免疫反应,并在宿主对病原体的防御中发挥重要作用。干扰素(IFN)在固有免疫系统中占有重要地位,主要通过调控干扰素上下游基因发挥抗病毒作用。近年来,大量文献报道在RSV感染细胞后,E3泛素连接酶通过调控干扰素通路的上下游基因来参与病毒感染后的免疫应答。目前,关于Cbl-b在抗病毒固有免疫应答中的作用鲜有报道。目的:本项研究旨在探讨Cbl-b在RSV感染时对IFN的调控作用及机制,为呼吸道合胞病毒感染的治疗提供新思路。方法:通过对WT和Cbl-b基因敲除小鼠(Cbl-b/-)滴鼻感染RSV,取出肺组织,进行HE染色,观察肺组织病理情况,同时观察脾脏的大小。利用实时荧光定量PCR检测肺组织中IFNα、IFNβ、IFNγ及炎症因子IL-6、IL-10、TNFα和RSV N、RSVF的表达量。建立WT和Cbl-b-/-滴鼻携带红色荧光m-Cherry的RSV小鼠感染模型,取出肺支气管灌洗液(BALF)与肺组织并将肺脏组织剪切消化成单细胞悬液,表面染色标记出上皮细胞、巨噬细胞、pDC,利用流式细胞仪观察RSV对不同细胞的感染。将BALF中细胞与肺组织细胞进行表面染色标记并用PMA、Ionomycin、BFA活化巨噬细胞、pDC后胞内染色IFNγ。并利用实时荧光定量PCR检测 BALF 中 IFNα、IFNβ、IFNγ及 IL-6、IL-10、TNFα 和 RSV N 的表达量。体外培养MΦ(巨噬细胞)与pDC,将两种细胞均感染RSV,利用实时荧光定量PCR检测感染后IFNα、IFNβ、IFNγ及IL-6、IL-10、TNFα和RSVN的表达量。将MΦ与pDC共培养并感染RSV,利用实时定量PCR检测共培养后两种细胞的IFNα、IFNβ、IFNγ及RSVN表达量。体外培养pDC并感染RSV,分别利用胞内染色与实时荧光定量PCR检测T-bet、GATA3蛋白水平与转录水平的变化。利用Western Blot检测干扰素通路上游分子MDA5、RIG-I、TBK1、p-TBK1、IRF3及下游分子JAK1、STAT1、p-STAT1 的变化。通过构建鼠源 IRF3-Flag、Cbl-b-Myc、Ub-HA 质粒,将三种质粒共同转入293T细胞中,利用免疫共沉淀检测Cbl-b是否泛素化IRF3。结果:与WT感染组相比,Cbl-b-/-感染组肺组织炎症明显减轻,血管周围淋巴细胞浸润减少,肺泡腔内少量炎性渗出,同时观察WT小鼠感染RSV后脾脏明显增大而Cbl-b-/-感染组小鼠脾脏正常。Cbl-b-/-感染组肺组织中IFNα、IFNβ、IFNγ明显升高,IL-6、IL-10、TNFα明显降低,RSVN、RSVF明显降低,提示在肺组织中,Cbl-b-/-小鼠RSV感染量偏低。在BALF中,Cbl-b-/-小鼠RSV感染量亦明显较低。流式细胞仪检测发现,肺组织中,巨噬细胞是主要感染RSV的细胞,上皮细胞、pDC中RSV感染量较低,在BALF中,巨噬细胞仍是感染RSV的主要细胞,而pDC感染量较低。无论在肺组织还是BALF中pDC的IFNγ表达量均较巨噬细胞高,而在BALF中,与WT感染组相比,Cbl-b-/-感染组pDC的IFNγ表达量较高。体外细胞培养实验证明,在巨噬细胞中,与WT相比,Cbl-b-/-RSVN较低,IFNα、IFNβ、IFNγ较高,炎症因子表达较低;在pDC中,与WT相比,Cbl-b-/-RSVN较低,而IFNα、IFNβ、IFNγ较高,炎症因子表达较低。MΦ与pDC共培养,发现与WT相比,Cbl-b-/-的pDC可产生大量IFNα、IFNβ、IFNγ。相对于pDC,巨噬细胞表现出更多的RSV感染。WT与Cbl-b-/-的pDC感染RSV后T-bet与GATA3表达量未见明显差异。而Cbl-b-/-的MDA5、IRF3、STAT1表达升高,且IRF3升高较为显著。Cbl-b可以泛素化IRF3。结论:Cbl-b缺失可减轻RSV引起的肺部炎症,Cbl-b通过调控Ⅰ型干扰素通路影响pDC中干扰素的产生,从而抑制RSV在巨噬细胞中的复制。Cbl-b可以泛素化IRF3。因此,干扰Cbl-b有望成为RSV引起的呼吸道感染的炎症治疗的新靶点。