【摘 要】
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目的构建离子通道相关蛋白FXYD6的真核表达载体pcDNATM3.1/myc-His（-） B- FXYD6,瞬时转染哺乳动物细胞293T细胞,并检测其目的蛋白表达和在细胞中的定位情况,为进一步的动物实验研究打下基础。构建功能区原核表达载体pET-28a（+）-FXYD6-ex,并诱导其在原核细胞中表达,对表达出的功能区重组蛋白进行纯化,以进一步制备该蛋白不同表位的抗体,为研究FXYD6蛋白的组织
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目的构建离子通道相关蛋白FXYD6的真核表达载体pcDNATM3.1/myc-His（-） B- FXYD6,瞬时转染哺乳动物细胞293T细胞,并检测其目的蛋白表达和在细胞中的定位情况,为进一步的动物实验研究打下基础。构建功能区原核表达载体pET-28a（+）-FXYD6-ex,并诱导其在原核细胞中表达,对表达出的功能区重组蛋白进行纯化,以进一步制备该蛋白不同表位的抗体,为研究FXYD6蛋白的组织分布和的具体功能奠定基础。方法用全长FXYD6 cDNA序列分别扩增FXYD6全长序列和其功能区片段FXYD6-ex,扩增产物插入到克隆质粒载体pMD18-T Simple中,将连接产物载化到克隆宿主大肠杆菌Trans10中进行TA扩增,抽提质粒,将质粒和真核表达载体pcDNATM3.1/myc-His（-） B空载体用限制性内切酶双酶切,DNA电泳,目的片段回收与纯化,全长序列目的片段插入到酶切后的空载体pcDNATM3.1/myc-His（-） B中,功能区目的片段插入到以相同限制性内切酶双酶切后的表达质粒载体pET28a（+）中,两种重组质粒重新转化到大肠杆菌Trans10扩增质粒,抽提质粒,经PCR电泳和测序证实两种质粒正确。重组质粒pcDNATM3.1/myc-His（-） B-FXYD6瞬时转染哺乳动物细胞293T细胞,用western blot检测其目的蛋白表达,其所长并用细胞免疫荧光检测目的蛋白的细胞分布情况。重组质粒pET28a（+）-FXYD6-ex转化宿主大肠杆菌Rossetta,异丙基-β-8-D硫代半乳糖（IPTG）诱导功能区重组蛋白表达,镍柱纯化,用十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝胶和western blot检测,鉴定功能区重组蛋白表达及纯化情况。结果本实验成功构建了真核表达载体pcDNATM3.1/myc-His（-） B-FXYD6,并实现了其在293T细胞的表达, FXYD6主要分布在细胞质和细胞膜上。成功构建了原核表达载体pET28a（+）-FXYD6-ex,通过IPTG诱导实现了该蛋白功能区在大肠杆菌Rossetta中的高表达,用镍柱纯化后的重组蛋白纯度达90%。结论1、本研究成功完成了离子通道相关蛋白FXYD6真核表达载体pcDNATM3.1 /myc-His（-） B-FXYD6的构建并实现了它的真核表达, FXYD6蛋白主要分布在细胞质和细胞膜上。2、本研究也实现了它的功能区的原核表达及纯化,纯化后的重组蛋白为后续制备该蛋白单克隆抗体库及进一步研究其具体功能奠定了良好基础。
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