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前言RNA干扰(RNA interference, RNAi)是正常生物体内抑制特定基因表达的一种现象,它是指当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA(double stranded RNA, dsRNA)时,该mRNA发生降解而导致基因表达沉默的现象,这种现象发生在转录后水平,又称为转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing, PTGS)。外源dsRNA进入细胞后产生的小分子干扰RNA(small interfering RNA, siRNA)的反义链和多种核酸酶形成了沉默复合物(RNA-induced silencing complex, RISC), RISC具有结合和切割mRNA的作用而介导RNA干扰的过程。RNAi具有特异性和高效性。早期生长反应因子-1(early growth response factor-1,Egr-1)是一种锌指结构转录因子,不仅与细胞生长有关,而且参与多种细胞的正常分化、凋亡,与心血管疾病的病理过程有密切关系。Egr-1在正常血管壁中低水平表达或不表达,而在动脉损伤和其他多种刺激下表达上调,并促进相关基因的转录和表达,诱导血管平滑肌细胞的分裂、增值和内膜增生。实验方法一、大鼠VSMC培养大鼠A10主动脉VSMC细胞株采用高糖DMEM培养基培养,其中含有10%FBS、100U／ml青霉素、100μg／ml链霉素,置于37℃、5%C02饱和湿度培养箱内培养。每2-3天换液一次。至单层细胞生长近汇合时,予以传代：弃去旧培养基,PBS冲洗2次,加入0.25%胰蛋白酶消化,观察细胞变圆,细胞间隙扩大,弃去消化液,加入新培养基,吹打瓶壁上的细胞,形成均匀单细胞悬液,按所需浓度转移至新50ml玻璃培养瓶,置于上述环境中继续培养。二、实验(一)VSMC饥饿处理48h后,用10％胎牛血清刺激,分别收集0h、0.5h、1h、2h、12h、24h的VSMC,提取RNA并调整浓度,反转录后扩增,进行电泳,EB染色,凝胶自动成像分析系统扫描成像,测Egr-1mRNA的值。(二)VSMC饥饿处理48h后,用10%胎牛血清刺激,分别收集0h、1h、2h、4h、24h的VSMC,用western-blot法检测Egr-1蛋白的值。(三)制备Egr-1的siRNA,转染至VSMC,应用血清刺激1h和2h收细胞测量Egr-1RNA和蛋白值。实验结果一、与对照组(内参GAPDH)相比,随时间推移,Egr-1mRNA含量逐渐升高,在1h达到峰值后又逐渐降低(P<0.05),而GAPDH值无明显变化(P>0.01)。二、与对照组(内参β-actin)相比,随时间推移,Egr-1蛋白含量逐渐升高,在2h达到峰值后又逐渐降低(P<0.05),而β-actin值无明显变化(P>0.01)。三、siRNA可显著抑制VSMC的Egr-1的表达,与空白组(无转染siRNA)和阴性对照组(转染无效siRNA)相比,Egr-1mRNA及蛋白在峰值的含量明显降低(这P<0.05),而内参GAPDH和β-actin的值无明显变化(P>0.01)。结论一、VSMC饥饿后予血清刺激Egr-1的mRNA在1h达到峰值,蛋白在2h达到峰值。二、siRNA可显著抑制VSMC的Egr-1的mRNA和蛋白的表达。