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前言： HPV16 E6/E7调控Glut1表达的具体机制不清。我们发现肺癌及癌前期病变细胞中HPV16 E6/E7、HIF-1α及Glut1表达增高，并且HPV16 E6/E7与HIF-1α和Glut1呈正相关。已有报道HPV16E6或E7可上调HIF-1α的活性，另有报道HIF-1α可上调Glut1的mRNA和蛋白表达，但HPV-16 E6/E7是否可介导HIF-1α上调Glut1的表达，促进转运更多的葡萄糖来满足癌细胞的高代谢率和增长速度现在还不清楚。为此我们拟用p-EGFP-N1-HPV16 E6/E6mut、p-EGFP-N1-HPV16 E7/E7mut及p-EGFP-N1质粒以脂质体法转染细胞株，检测E6、E7、HIF-1α、Glut1的蛋白和mRNA表达;siRNA沉默HPV16E6后，检查HIF-1α及Glut1的表达变化，明确HPV-16上调Glut1表达的具体机制。 材料与方法： 一、材料 （一）临床资料 收集2011年1月至2012年7月中国医科大学附属第一医院门诊及病房胸水标本150例，其中肺腺癌92例，肺鳞癌3例，炎症35例，结核20例。 （二）细胞系 肺癌细胞系A549（人肺腺癌系）、H1299（人肺腺癌系）、NCI-H460（人大细胞肺癌系）均购自上海中科院细胞生物所，用含10％小牛血清的RPMI-1640培养液进行传代。LK2（人肺鳞癌细胞系）购自上海中科院细胞生物所，用含10％小牛血清的DMEM培养液进行传代。血清、RPMI-1640培养液及DMEM培养液购自Hyclone公司。 （三）实验用品 1、主要试剂 HPV16E7兔抗人多克隆抗体、Glut1山羊抗人多克隆抗体、HIF-1a兔抗人多克隆抗体及HPV16E6兔抗人多克隆抗体均购自北京博奥森生物公司，DAB酶底物显色试剂盒和S-P超敏试剂盒均购自福州买新生物技术开发公司，Real-timePCR引物购自南京金斯瑞生物科技有限公司，Prime Script RT reagent Kit(Perfect Real Time)及SYBR Premix Ex TaqTMⅡ购自TaKaRa公司，Lipo2000购自上海英潍捷基，p-EGFP-N1-HPV16 E6/E6mut、p-EGFP-N1-HPV16 E7/E7mut及p-EGFP-N1质粒均由广东医学院生物化学与分子生物学研究所唐旭东教授惠赠。 2、试验仪器 摊、烤片机(LS-90) 沈阳龙首电子仪器公司； 冰箱 青岛海尔股份有限公司； 恒温箱 沈阳医疗器械厂； 电热恒温鼓风干燥箱 上海森信实验仪器有限公司； 免疫组化保湿盒 福州迈新生物技术有限公司； 医学图像采集分析系统 日本Olympus公司； 低温超速离心机和低速离心机Hitachi，日本； 紫外分光光度计和凝胶成像系统UVP，英国； CO2培养箱Heraeus，德国； 超净台 苏州净化设备； ABI 7900HT仪器Applied Biosystems,USA； NanoDrop ND-1000 spectrophotometer (Wilmington,USA)； 基因扩增仪G-Storm，英国； 电热压力蒸汽灭菌器 上海申安医疗； 超声细胞粉碎机 宁波新芝； 电泳及转印仪Bio-Rad，美国； 酶标仪Bio-Rad，美国。 二、方法 1、免疫细胞化学技术 采用链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶(S-P)法行抗HPV16E6(1∶200)，HPV16E7(1∶200)，Glut1(1∶100)免疫细胞化学染色。细胞块切片，常规脱蜡至水，高温进行抗原修复，一抗4℃孵育过夜，DAB显色，苏木素复染。用PBS代替一抗作为阴性对照，用已知阳性肺癌切片做阳性对照。 2、细胞瞬时转染和转染效率测定 转染前一天将细胞按60％-70％密度接种于6孔板，采用Lipofectamine TM 2000(英潍捷基，上海)转染试剂按照说明书进行转染，24h测转染效率，并终止细胞培养，用于后续试验。流式检测转染效率。 3、Real-time PCR实验 利用PrimeScript RT reagent Kit (Perfect Real Time)合成特异性的cDNA，总反应体系10μl（总RNA5μl），在基因扩增仪（G-Storm，英国）内经过如下循环完成反转录实验过程:37℃，15min;85℃，5see，4℃贮存，次日扩增待用。Real-time PCR在Applied Biosystems 7900HT Fast Real-time PCR System (Applied Biosystems，USA)内完成。反应体系20μl，包括cDNA0.25μl，按照SYBR Premix Ex TaqTMⅡ优化程序进行扩增，采用相对定量的方法，循环过程如下:95℃，30sec;95℃，15sec;60℃，30sec;40个循环。实验组及对照组均设2次重复。用3次独立样本经过3次独立实验后得到的数据用公式RQ=2-△△△Ct的方法进行分析。 4、Western blot 收集培养的细胞，加入蛋白裂解液充分裂解，4℃静置，孵育40min，4℃离心20min(12000g/min)，取上清，放入-70℃冰箱保存。用Brodford法测蛋白浓度，每孔50ug蛋白上样量，12％SDS-PAGE凝胶电泳，4℃，40V条件过夜，湿电转移仪将蛋白转入0.22umPVDF膜，5％脱脂奶粉封闭2h，一抗HPV16E6(1∶100),HPV16E7(1∶100),HIF-1a(1∶200),Glut1(1∶200),GAPDH(1∶1000),β-action(1∶1200)4℃过夜，37℃二抗孵育2h，化学发光，显影，以β-actin、GAPDH为内参，用凝胶成像分析系统（BioImaging Systems，美国）分析蛋白条带灰度值，每组结果均为相同条件重复3次。 三、统计学分析 应用SPSS19.0统计软件进行数据处理:采用mean±SD分析各组数据的平均值和标准差。采用One way ANOVA，Dunnett T3进行统计分析，P＜0.05为差异有统计学意义。 结果： 1.HPV16、HIF-1α和Glut1在部分肺癌患者胸水中的表达水平明显增高 2.转染效率的检测介于39.85％至47.09％。 3.在非小细胞肺癌细胞中HPV-16 E6和E7癌蛋白增强HIF-1α蛋白及mRNA的表达 4.在非小细胞肺癌细胞中HPV-16 E6和E7癌蛋白增强Glut1蛋白及mRNA的表达 5.LK2、A549细胞系进行HPV16 E6-siRNA干扰后HPV16E6、HIF-1α及Glut1蛋白水平及mRNA水平表达降低 6.LK2、A549细胞系进行HIF-1α-siRNA干扰后HIF-1α及Glut1蛋白水平及mRNA水平表达降低 结论： HPV16E6和E7均可介导HIF-1α上调Glut1的蛋白和mRNA表达，增强肺癌细胞的葡萄糖转运，促进肺癌细胞的糖酵解作用。HPV16E6/E7有可能作为HPV相关非小细胞肺癌的预防和治疗的潜在靶点。