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以转基因细胞作为供体细胞,利用核移植技术生产转基因动物是目前转基因家畜的主要技术手段。针对与牛生长发育和肉质改善相关的基因,我们构建了牛卵泡抑素基因真核表达载体、牛卵泡抑素基因与ω-3多不饱和脂肪酸去饱和酶基因真核共表达载体,并转染到和牛胎儿成纤维细胞中。在对转基因细胞进行检测后,通过体细胞核移植技术制备转基因胚胎。利用Trizol提取转基因胚胎的总RNA,并通过RT-PCR(反转录PCR)的方法扩增外源基因,验证基因在胚胎中的表达。
1.牛卵泡抑素基因真核表达载体构建
用Trizol法从牛的卵巢中提取总RNA,反转录成cDNA,用带有酶切位点的牛卵泡抑素基因(Follistatin,FST)的特异性引物扩增其完整编码区序列,连接到T载体、测序,序列无误后亚克隆入真核表达载体pIRES2-AcGFP1中,经酶切及PCR鉴定表明成功构建了真核表达载体pIRES2-AcGFP1-FST。
2.牛卵泡抑素基因与ω-3多不饱和脂肪酸去饱和酶基因真核共表达载体构建
用带有酶切位点的特异性引物扩增本实验室已有的人缘化的线虫ω-3多不饱和脂肪酸去饱和酶基因fat-1完整编码区序列,连接到T载体、测序,序列无误后亚克隆入真核表达载体pIRES2-AcGFP1-FST中,替换AcGFP基因,经酶切及PCR鉴定表明成功构建了真核表达载体pFST-1RES2-FAT1。
3.和牛胎儿成纤维细胞的体外培养及基因转染
使用组织块贴壁法得到和牛胎儿成纤维细胞,使用LipofectamineLTX将表达载体pIRES2-AcGFP1-FST和pFST-IRES2-FAT1分别转入和牛胎儿成纤维细胞基因组中。使用G418药物筛选转基因细胞,pIRES2-AcGFP1-FST转染的细胞利用绿色荧光蛋白进一步得到细胞克隆,而pFST-IRES2-FAT1转染的细胞利用PCR的方法鉴定转基因细胞克隆。
4.转基因胚胎的制备与基因表达鉴定
常规技术将转pIRES2-AcGFP1-FST和pFST-IRES2-FAT1的转基因供体细胞融入去核卵母细胞中。经体外培养获得克隆囊胚。用Trizol提取转基因胚胎总RNA,并通过RT-PCR(反转录PCR)的方法扩增外源基因,验证了基因在胚胎中的表达。