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芜菁花叶病毒(Turnip mosaic virus,TuMV)是马铃薯Y病毒科马铃薯Y病毒属的一个重要成员,是世界各地广泛分布的重要植物病毒病原之一,主要危害十字花科植物,造成农作物严重减产。TuMV基因组所编码的HC-Pro蛋白不但与蚜虫传毒、病毒的胞间移动和病症表现相关,而且也是一个病毒沉默的抑制子。本研究克隆了TuMV HC-Pro基因,构建真核表达载体TRBO HC-Pro,并在本氏烟中获得高效表达,蛋白纯化后作为抗原制备多克隆抗体。HC-Pro多抗的研制为TuMV病毒的检测,以及HC-Pro与寄主和病毒的其他蛋白的互作研究打下基础。
根据已报道的TuMV HC-Pro基因序列,设计两条分别带有PACI和AVRⅡ酶切位点的引物,通过RT-PCR方法,从感染TuMV的烟草病叶中扩增获得了TuMV HC-Pro基因,纯化PCR产物,连接pMD-18T克隆载体,转化E.coli DH5a菌株,PCR和双酶切鉴定阳性重组质粒并测序。测序结果表明所克隆的TuMVHC-Pro基因的序列为1410个核苷酸,编码470个氨基酸,与GenBank上登录的TuMV其他8个分离物((登录号AM410979,AJ831794,AB093609,AJ831799,AB093605,AB194802,AJ314826,AJ438192)的HC-Pro基因的核苷酸和氨基酸进行同源性比较,同源率分别为85％～99％和94％～98％。
采用内切酶PacⅠ和AvrⅡ分别对重组质粒pMD HC-Pro和植物表达载体TRBO pJL50进行双酶切,两者连接并转化E.coli DH5α菌株,卡那霉素筛选抗性菌落,经PCR、酶切及测序鉴定,获得了真核表达载体,并命名为TRBOHC-Pro。
将重组质粒TRBO HC-Pro导入根癌农杆菌,通过农杆菌浸润接种的方法使HC-Pro基因在本氏烟叶片中进行高效表达。SDS-PAGE和Western blot分析表明,HC-Pro基因在本氏烟中表达所产生的蛋白分子量大小约为53 kDa,与预期大小一致,Ni+-NTA亲和柱纯化获得同样分子量大小的融合蛋白。
以纯化的重组蛋白为抗原免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体。间接酶联免疫法检测结果表明:HC-Pro多克隆抗体的效价可达到1:24000,最佳工作浓度为1:12000。Western blot检测结果表明制备的多克隆抗体与纯化的HC-Pro能发生特异性反应,此抗体与HC-Pro和TuMV病毒样本呈阳性反应,而与异源植物病毒无交叉反应,因而该抗体可应用于HC-Pro以及TuMV病毒的特异性检测。