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本论文工作的重点是与人类疾病相关的蛋白质的结构域的克隆,表达以及结构和功能研究。我们克隆,表达和纯化了人源蛋白质vinexin C端的第一个SH3结构域(V_SH3_1),并用NMR的方法测定了这个结构域的溶液结构。同时通过SPR和NMR化学位移干扰实验对这个结构域与来自Vinculin头尾连接端两个肽段P856(856-867)和P868(868-880)的结合性质进行了研究。给出了V_SH3_1溶液结构,并通过NMR化学位移干扰和Biacore实验确定Vinculin C末端两个肽段856-857和868-880分别与Vinexin的相互作用,并根据它们结合能力的大小,推测出Vinexin与Vinculin可能的相互作用方式。所有这些结果都有利于对Virlexin和Vinculin功能作进一步的研究。
论文共分三部分。第一部分是蛋白质Vinculin和Vinexin的研究背景和功能简介。Vinculin是在由整合素介导的细胞一胞外基质粘附和钙粘着蛋白介导的细胞-细胞粘附的粘着斑中大量存在的细胞骨架蛋白质。Vinculin通过与其他一些细胞骨架蛋白形成复合物而诱导整合素介导的细胞-胞外基质粘附的形成。实际上Vinculin表达量的大小直接影响细胞粘附性和运动性。Vinexin是在体外酵母双杂交实验发现与Vinculin作用的蛋白质。Viflexin-般有α和β两种表达剪切体,两者在C端含有相同序列的三个SH3结构域,而α还有一个长的N端。Vinexin通过其前两个SH3结构域与Vinculin的头尾连接区的一段长的脯氨酸富集区结合。Vinexinα和β一般定位于NIH 3T3纤维原细胞以及LLC-PK1细胞的细胞-细胞粘附的粘着斑。Vinexin蛋白质的表达能增加粘着斑的形成面积,Vinexin α能正调控肌动蛋白应力纤维的构象形成。另外Vinexinβ的稳定表达也能促进细胞在纤丝蛋白上扩散。这些证据都显示Vinexin是一类新的粘着斑和细胞-细胞粘附蛋白质,它可以通过其SH3结构域与Vinculin的头尾连接区结合,从而增强肌动蛋白骨架组织的形成和细胞扩散能力。
在第二章中,利用NMR波谱测定了Vinexin的第一个SH3结构域(V_SH3_1)的溶液结构。Virlexin在C-末端有三个SH3结构域,这些结构域是Vinexin与其它蛋白质作用的结合区域。已有文献报导Vinexin与Vinculin的相互作用是通过其前二个SH3结构域结合到Vinculin的头尾连接区的长的脯氨酸富集区上。编码V_SH3_1的基因在大肠杆菌中得到了克隆和表达。利用Ni离子亲和层析法,这个重组蛋白质的纯度可以达到90%以上。通过异核三维核磁共振的方法,V_SH3_1的溶液结构得到了测定。V_SH3_1的结构表现为β-β-β-β-α-β的折叠。我们能近似得到这5段β折叠作为主要的二级结构分布在:Arg2到Va16(β1):Ile25到Asp28(β2);Trp37到Glu41(β3);Lys44到Pro49(β4);Val53到Glu55(β5)。这些β折叠相邻之间都是反平行结构,其中β1和β5,β1和β2,β2和β3,β3和β4都是反平行的β折叠。连接这些β折叠的是三个loop区,分布是RT loop(Glnl3到Asp16),n-Src loop(Glu34和Trp36),distal loop(Leu41到Lys44)。这些loop区域在溶液状态都是处于自然伸展的柔性摆动,因此可能在V_SH3_1和它的底物相互作用过程中扮演重要角色。序列比对以及结构比对显示V_SH3_1在SH3家族中具有很高的保守性,这种序列和结构的保守性暗示了SH3家族蛋白质在行使蛋白质功能时的相似性。虽然整体结构的相似性,V_SH3_1在某些局部区域与其他SH3结构域有某些差异,主要表现在某些残基侧链的长度和极性上,V_SH3_1底物结合区域上这些残基的差异,可能会影响到V_SH3_1与底物结合的亲和强度。第三章是关于V_SH3_1与Vinculin的头尾连接区的长的脯氨酸富集区多肽的相互作用的研究。结果显示V_SH3_1与P856和P868作用的解离常数分别是1.05×10<-3>M和1.16×10<-5>M,V_SH3_1与P856属于弱相互作用,而与P868则属于中等强度的相互作用。我们的化学位移perturbation,SPR实验结果清楚表明V_SH3_1与2个小肽作用都是在其表面形成了相同的3个疏水口袋。由Glu16,Pr048 and Trp35形成的第3个疏水口袋对稳定复合物的结构是至关重要的,它的碱性氨基酸Glu16与P868的Arg7有静电相互作用,这可能也是P868对V_SH3_1的结合能力要P856强约86倍的原因。我们推断第1个SH3结构域是与P868结合而第2个SH3结构域是与P856作用。