第一部分 Map2k6基因座内三个片段敲除小鼠的制备　　 基因打靶(gene targeting)是20世纪80年代兴起的分子生物学技术，其基本原理是将外源DNA序列导入靶细胞，利用同源重组将外源DNA序列定点整合到靶细胞基因组中。基因打靶作为新型的基因操作技术，主要应用于基因功能研究及遗传病基因治疗等方面。　　 先天性全身性终毛增多症(Congenital Generalized Hypertrichosis Terminalis，CGHT，MIM ID:135400)是一种极为罕见的遗传病，其发病特点为不依赖雄性激素的全身性毛发过度生长，且不受年龄，种族及性别影响，因此该病又称“狼人综合征”，曾一度被认为是人类“返祖现象”(Atavism)。该病致病机理一直不清楚，直至2009年本课题组将CGHT致病区域定位于17q24.2-q24.3，该区域的拷贝数变异(Copy Number Variation，CNV)在该病中起决定性作用，并提出包括Map2k6等在内的四个基因可能为CGHT的致病基因。然而，CGHT作为一种极为罕见的遗传病，发病率低，加上该病的高度遗传异质性，其具体致病机理研究仍存在较大困难。　　 CGHT致病区域包含四个蛋白编码基因，分别为ABCA5(MIM612503)，ABCA6(MIM612504)，ABCA10(MIM612508)和MAP2K6。而有文献报道，在正常汉族人群中ABCA5，ABCA6, ABCA10三个基因缺失却未发病，从而使MAP2K6基因成为CGHT的候选基因。MAP2K基因主要编码蛋白为丝裂原活化蛋白激酶激酶6，该基因突变会导致一系列类似于CGHT患者的面部特征，但未出现毛发过度生长这一主要表型，而且Map2k6的基因敲除小鼠也没有CGHT表型。然而，已有的Map2k6基因敲除小鼠一般都是将该基因的编码序列敲除，而很少对其潜在的调控区进行研究。而近年随着非编码区(noncoding region)慢慢被人们重视，非编码区在维持染色体结构和功能、基因表达调控、着丝粒以及有丝分裂中同源序列的识别上可能有重要功能。因此我们的思路是通过小鼠模型来研究Map2k基因座的非编码序列是否是导致CGHT的发病原因。Map2k6基因位于小鼠11号染色体上，通过比较基因组学研究，我们发现该基因座存在两段非常保守的区域和一段表达序列标签(Expressed Sequence Taq，EST)富集区，而这类区域一般在基因表达调控上发挥着重要功能。　　 本课题旨在利用三个已构建好的打靶载体分别转染胚胎干细胞，产生相应的基因打靶胚胎干细胞克隆，进而制备Map2k6的基因敲除小鼠。并以此为研究对象对Map2k6基因座内非编码序列与CGHT的潜在关系进行研究，并期望揭示CGHT发病机制。　　 方法：　　 1、大量制备并纯化已构建好的三个打靶载体(KO-1，KO-2，KO-3)，将它们线性化后分别电穿孔转染状态良好且未分化的C57BL/6N背景的小鼠ES细胞株JM8A3，经过药物筛选后得到一定数目的药物抗性ES细胞克隆，并通过PCR初步鉴定发生同源重组的阳性细胞克隆;　　 2、通过Southern blot进一步鉴定同源重组阳性细胞克隆，然后对阳性克隆进行中期染色体制备，通过染色体计数挑选出二倍体百分率较高的克隆进行后续实验;　　 3、对Southern blot鉴定阳性且二倍体百分率较高的细胞克隆进行相关多能性鉴定，将具有较高多能性的阳性克隆培养到良好状态后进行囊胚注射，然后将囊胚移植到假孕鼠子宫中，最终获得嵌合体小鼠;　　 4、将6-8周的嵌合体小鼠与野生型C57小鼠交配，进行突变基因种系传递验证。　　 结果：　　 1、成功将线性化的三个打靶载体分别导入小鼠胚胎干细胞JM8A3中，经过药物筛选后获得一定数目的药物抗性克隆，并对部分克隆进行了PCR初步鉴定。　　 目前，已获得3株KO-1同源重组阳性细胞克隆，16株KO-2随机整合阴性细胞克隆及2株KO-3同源重组阳性细胞克隆;　　 2、对3株KO-1同源重组阳性克隆进行Southern blot验证，并对其进行中期染色体制备，统计这三株克隆二倍体百分率，结果提示该三株克隆染色体条数正常，适合做囊胚注射;　　 3、对3株KO-1细胞克隆进行多能性评估，结果提示它们均具备良好的多能性。将这3株克隆进行囊胚注射，共获得4只嵌合体小鼠，其中一只因发育异常出生后不久死亡，另3只状态良好。目前正在对这三只小鼠进行突变基因种系传递实验。　　 结论：　　 本课题已获得KO-1， KO-3靶向敲除阳性ES细胞克隆，并通过囊胚注射获得KO-1嵌合体小鼠;KO-2也获得一定数量克隆，并通过初步鉴定可能为靶向敲除阳性克隆。　　 第二部分色素异常遗传病致病基因突变分析　　 非综合征色素异常遗传病是一类由于黑色素合成异常导致的皮肤色素病变，患者主要表现为色素减退、沉着或毛发色素减退。此类疾病主要包括遗传性对称性色素异常症，白化病，斑驳病，白癜风等。　　 遗传性对称性色素异常(dyschromatosis symmetrica of hereditaria, DSH，OMIM27400)是一种较少见的常染色体显性遗传病，患者主要临床表现为手足背侧的对称性的色素沉着斑或减退斑，一般婴幼儿时期开始发病。该病在中国和日本较多见，ADAR基因为DSH的主要致病基因。本研究在我们收集到的一个DSH家系中，通过PCR对患者ADAR基因外显子，及外显子/内含子衔接区进行扩增和PCR产物测序，结果发现了ADAR基因外显子4存在错义突变:c.1834G＞A，导致该基因编码蛋白第612位甘氨酸被精氨酸取代(p.G612R)，迄今国内外尚无该突变的报道。我们在患者家系和正常人群中进行突变致病性验证，发现家系中所有两名患者均携带该突变，而在正常人中不存在。总之，我们在ADAR基因中发现了一个DSH致病新突变(c.1834G＞A p.G612R)，进一步丰富了ADAR基因突变谱。　　 白化病(albinism)是一种较常见的由黑色素缺乏引起的隐性遗传病。主要表现为皮肤，毛发和（或）眼部色素减少，大部分患者还会出现斜视，畏光，眼球震颤等症状。白化病具有较强的遗传异质性，目前主要分为非综合征白发病和综合征白化病，非综合征白发病主要包括四种类型:Ⅰ-Ⅲ型均为眼皮肤白化病，共同表现为毛发、皮肤及眼部色素减少。三者主要区别是:OCA1最为常见，致病基因为TYR基因; OCA2临床表现跟OCA1类似，但OCA2病人会随年龄增长色素少量增加，致病基因为P基因;OCA3患者表现铜红色皮肤和毛发，致病基因为TYRP1;另外一种白化病为眼白化病(OA)，为X连锁遗传，患者仅眼部出现色素减少，致病基因为OA1基因。本研究收集到3个典型白化病家系，对先证者TYR基因外显子及外显子/内含子交界处进行PCR-测序，发现三家系均存在TYR基因突变:家系1突变为c.896G＞A（p.R299H）/C.1038-11_-7delTTAATinsAAA;家系2突变为c.896G＞A(p.R299H)/c.1199G＞T(p.W400L);家系3突变为c.929_930insC(p.R311fsX317)/C.1038-11_-7delTTAATinsAAA。上述突变在国外文献中均有报道，我们再次在中国人群中证实了其致病性。　　 斑驳病(piebaldism)是一种先天性常染色体显性遗传病。患者主要表现为头、额及躯干和四肢出现不规则的白斑，合并白色毛发，也有人称之为部分白化病。本研究收集1例斑驳病散发病例，提取患者外周血总RNA，通过RT-PCR和基因测序，对其KIT基因进行序列分析。测序结果表明患者KIT基因存在错义突变c.1786G＞A(p.596G＞S)，目前尚无该突变的报道。该突变位于KIT因外显子12，进一步通过PCR-限制性酶切(DdeI)对患者及群体50名正常对照进行突变点验证，确认该突变仅存在于患者，为斑驳病致病突变。