菊花(Chrysanthemum grandiflorum)原产我国,品种丰富,色彩多变,形态各异,具有较高的观赏价值和经济价值。生产上经常采用远缘杂交的方法,利用野生菊中的优良抗性性状来对具有良好观赏性状的栽培菊进行品种改良。然而在此过程中,胚胎败育的现象常有发生。本人所在实验室研究者们从细胞学、形态学水平以及高通量测序等方面对远缘杂交胚胎败育现象进行了研究。本论文在前人研究的基础上,分析了miRNA调控胚胎败育的机理;通过克隆胚胎发育相关基因CmERF12并构建植物表达载体,对其表达特性、亚细胞定位及转录激活活性等进行了研究;构建了‘雨花落英’高效再生和遗传转化体系,并获得转基因菊花,为后续基因功能鉴定提供了基础;通过异源转化拟南芥,初步揭示了胚胎败育的分子机理。主要研究结果如下:1.以栽培型地被菊‘雨花落英’为母本,四倍体菊花脑为父本进行杂交,取授粉后12 d及18 d正常和败育的胚胎进行高通量测序,得到差异表达的基因和miRNA。通过Blast 比对和功能注释,初步确定了 unigene、miRNA及其靶基因的功能,并利用荧光定量法验证了它们在胚胎发育过程中的表达差异。结果表明,在定量验证的12个基因中,有9个基因在NE18表达量最高,如Dof,WRI1,2S,OLE等;转录因子NAP在NE18表达量最低,在AE18表达量最高;与乙烯响应相关的转录因子ERF12在败育胚胎中(AE18)表达量明显高于正常胚胎。在定量验证的12个miRNA中,有 7 个在 AE18 中表达量最高,如 miR169b、miR159a 和 miR858b;miR167c-3p 在NE18中表达量最高;miR414在NE12中表达量最高。靶基因的表达受到miRNA的负调控,在9个靶基因中,转录因子WRKY48和NAC在AE18中表达量最高,而在NE12中相对表达量最低;一些与生长素和ATP合成相关的基因在AE18中表达下调。胚胎发育是一个复杂的过程,受到多种基因、miRNA的共同调控。2.对‘雨花落英’与四倍体菊花脑杂交后得到的胚胎转录组数据进行分析,筛选出在胚胎发育不同时期差异表达的基因CmERF12。设计特异引物,以‘雨花落英’为材料,通过普通PCR方法克隆得到其CDS序列:全长336bp,编码112个氨基酸;编码的CmERF12蛋白与拟南芥中AtERF12蛋白相似度较高。组织特异性表达分析,发现CmERF12基因在败育胚胎及茎中表达量较高。构建了绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)融合表达载体,基因枪法转化洋葱表皮细胞。亚细胞定位分析显示CmERF12定位在细胞核中。构建了酵母效应质粒pDEST-GBKT7-CmmERF12,并进行转录激活活性验证,结果显示,CmERF12均不具有转录激活活性。3.采用叶盘法,以‘雨花落英’叶片为外植体,通过调节激素配比,研究不同比例的6-BA和NAA对叶盘再生的影响,从而筛选出叶片离体再生最高效快速的体系。结果表明:组培苗不同苗龄以及外源植物激素配比对‘雨花落英’叶盘再生都具有显著的影响。当组培苗苗龄为30 d时,其叶片再生率明显高于苗龄为25 d和40 d的组培苗叶片。继代培养40 d后的组培苗在各类再生培养基上的再生频率均低于65%;苗龄为25 d的组培苗叶片,虽然在MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L的培养基上再生率达到80%,高于30d的组培苗,但是在培养后期,再生芽出现不同程度的玻璃化,因此不适合以此作为‘雨花落英’再生条件。以苗龄为30 d的组培苗幼嫩叶片为外植体,调节6-BA和NAA的比例,发现当6-BA浓度一定时,增加NAA的浓度,则不定芽的再生率提高;当6-BA的浓度提高到3.0 mg/L时,叶盘再生率下降,并且再生芽出现不同程度的玻璃化现象。综合各项指标,发现当用于实验的组培苗苗龄为30 d,再生培养基为MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA0.8 mg/L时,叶盘再生率最高,达91.11%,同时平均芽数高达5.90。4.在获得最佳再生培养基的基础上,通过筛选潮霉素、羧苄青霉素的浓度,探索预培养、延迟培养等遗传转化条件对转化效率的影响,并通过调整培养条件,使玻璃化苗恢复为正常苗,最终初步建立了‘雨花落英’遗传转化体系,获得转基因菊花。结果表明:‘雨花落英’叶盘对潮霉素的反应较为敏感,潮霉素叶盘筛选的最适选择压为8-10 mg/L,生根筛选最适浓度为11 mg/L;羧苄青霉素对农杆菌有较强的抑制作用,在本试验中,设置延迟培养基中羧苄青霉素最适浓度为400 mg/L,此时愈伤长势良好,且农杆菌被完全抑制;潮霉素和羧苄青霉素均采取逐步降低选择压的方法,以降低对叶盘的影响。‘雨花落英’最优的遗传转化组合为:预培养2 d,侵染7 min,共培养3d,延迟培养5 d。研究表明,6-KT可以有效提高抗性芽的再生率。将培养基中6-BA浓度降低至1.0 mg/L,蔗糖浓度增加到40 g/L,可以有效地将玻璃化苗转化为正常苗,从而提高了转化效率,获得了转基因抗性株系。对获得的15株转基因抗性株系进行分子鉴定,结果表明,阳性苗有10株,阳性苗概率高达67%;其中,有4个株系的CmERF12相对表达量比WT降低了 1倍多。这说明使用该体系能够成功获得了转CmERF12干扰株系。高效再生和遗传转化体系的构建,为验证基因功能,揭示胚胎败育机制奠定了良好基础。5.为了验证CmERF12在胚胎发育过程中的功能,利用植物表达载体pMDC32将它在模式植物拟南芥中进行异源转化,通过三代筛选,得到拟南芥转基因阳性植株,观察胚胎发育情况,统计败育率和正常种子萌发率,并利用qRT-PCR对胚胎发育相关基因进行定量验证。结果表明:通过农杆菌介导的花序侵染法最终获得三个表达量较高的CmERF12超表达株系(T3代),分别为ox-1,ox-2,ox-4。三个转基因株系的花器结构无明显变化,雌蕊发育正常,雄蕊为四强雄蕊,4个雄蕊花丝高度与雌蕊一致,花药开裂后,花粉能够顺利黏附在柱头上。拟南芥胚胎发育前期正常,排除了受精前障碍的可能性。在不同生长时期,转基因拟南芥角果出现了明显的败育现象。在胚胎发育早期,野生型和转基因株系胚珠发育正常,饱满,无明显败育现象;败育现象主要出现在第三个时期,转基因植株角果内胚珠发育明显发生异常,表面皱缩,颜色加深变褐;第四个时期即种子成熟期,野生型种子饱满,完成脱水成熟过程,而转基因株系败育现象明显,种子干瘪,不能正常发育而死亡。在三个转基因株系中,ox-1和ox-2败育现象明显,发生败育的角果数约为46.7%和40.0%,而ox-4败育角果约为16.7%。且发生败育的角果中,胚珠败育率均达到70%左右。结果表明,CmERF12在拟南芥中的异源过表达影响了拟南芥胚胎的正常发育。CmERF12导致植物胚胎败育主要在胚胎发育成熟时期发挥作用,主要通过抑制成熟时期转录因子表达、抑制蛋白质、油脂等物质的合成与储存;同时促进胚胎异常发育相关基因的表达来实现的。该结果提供了调控胚胎败育基因的基本特征及功能,为研究菊花胚胎发育分子机制奠定了良好基础。