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淇河鲫(Qihe crucian carp,Carassius auratus)是分布于河南豫北地区具有较高经济价值的天然三倍体鱼类。近年来,随着养殖密度增加,鱼类免疫力下降,常受到一些病原的入侵而爆发各种疾病,严重制约淇河鲫养殖业的发展。弄清鱼类对病原识别的天然免疫响应对于理解鱼类抵御病原感染相关免疫机制具有重要意义。Toll样受体(Toll-like receptor,TLR)是天然免疫系统细胞所表达的由胚系基因编码的一类重要模式识别受体,可识别病原保守的结构成分即病原相关分子模式(PAMPs),激活胞内信号通路,启动机体的免疫应答,在抵御病原感染方面发挥重要作用。本文采用基因克隆技术获得淇河鲫TLR1、TLR2和TLR4(分别命名为CaTLR1、CaTLR2和CaTLR4)的cDNA全长序列,并对其胚胎发育不同时期、病原及类似物处理和中草药活性成分添加饲料投喂后不同时间的表达响应进行系统分析。主要研究结果如下:(1)采用RT-PCR和RACE技术得到3种TLR基因cDNA序列。(1)CaTLR1的序列全长为2754 bp。其中5’端非编码区(5’-UTR)60 bp;开放阅读框(ORF)2394 bp,编码797个氨基酸;3’端非编码区(3’-UTR)300 bp。预测其分子量为91.5 kDa,理论等电点为6.57。(2)CaTLR2的序列全长为2605 bp。其中5’-UTR 36 bp;ORF 2367 bp,编码788个氨基酸;3’-UTR 202 bp。预测其分子量为90.3 kDa,理论等电点为7.57。(3)CaTLR4序列全长为2859 bp。其中5’-UTR 183 bp;ORF 2463 bp,编码820个氨基酸;3’-UTR 213 bp。分子量为94.2 kDa,理论等电点为8.28。3种TLR结构域及3D模型预测显示均具有TLR典型特征,包括LRR结构域、跨膜结构域和TIR结构域。同源性比对和系统发育分析结果显示其均与其它鲤科鱼类同源性最高,亲缘关系最近。(2)CaTLR1、CaTLR2和CaTLR4在淇河鲫胚胎发育不同时期及仔鱼期均广泛表达。在受精卵及卵裂期中mRNA表达量较高,随着胚胎发育这些基因表达量逐渐降低,均在出膜期达到最低值。基因表达量在出膜5天到25天均不同程度的增加,出膜30天表达量明显高于受精卵。这一结果显示CaTLR1、CaTLR2和CaTLR4表达量在胚胎发育中具有明显的动态变化。在出膜期前后基因表达量最低,预示该期病原识别和响应能力较弱,需要加强照管,以免病原侵染胚胎。(3)CaTLR1、CaTLR2和CaTLR4在不同组织器官中广泛表达,但其表达水平具有明显组织特异性。CaTLR1在肝脏和肌肉中表达量最高,其次是皮肤和头肾,在鳃和脑中表达量较低;CaTLR2在心脏和肌肉中表达量最高,鳃和脑中表达量较低;CaTLR4在肌肉和皮肤中表达量最高,其次是鳃和肠道,头肾和肾脏中较低。CaTLR1、CaTLR2和CaTLR4在卵巢中的表达量均最低。(4)LPS、PGN、PolyI:C和嗜水气单胞菌感染后CaTLR1、CaTLR2和CaTLR4表达响应为:CaTLR1在脾脏中显著上调表达,头肾中对LPS和嗜水气单胞菌有明显响应;CaTLR2和CaTLR4在LPS、PGN、PolyI:C和嗜水气单胞菌处理后均显著上调表达,但在不同组织器官间具有明显的组织差异性。这些表达差异显示这些基因在应对不同病原感染过程中免疫响应存在差异。(5)黄芪多糖或绿原酸添加饲料投喂后,CaTLR1、CaTLR2和CaTLR4的表达量上升,显示其可增强这些受体免疫响应能力。此外,黄芪多糖或绿原酸添加饲料投喂后,CaTLR2和CaTLR4对嗜水气单胞菌和PolyI:C的表达响应可进一步增强,显示黄芪多糖或绿原酸可通过增加TLRs表达,以增强机体对嗜水气单胞菌和PolyI:C的响应能力。