结直肠癌(CRC)是人类常见的消化道恶性肿瘤之一,在世界范围内居常见恶性肿瘤发病率的第三位。从世界范围看,我国是结直肠癌的低发区,但是随着社会进步,生活条件的改善和人们生活方式、饮食习惯的西方化,我国结直肠癌的发病率、患病率和死亡率呈明显的上升趋势。一般认为,结直肠癌的发生是一个多因素、多步骤的过程,是内因和多种外因(如生物、物理、化学、免疫等因素)交互作用的结果。但是具体哪种原因在肿瘤的发生过程中占据主导地位,尚不明确。自1972年Kerr、Currie和Wyllie提出细胞凋亡(Apoptosis)的概念以来,细胞凋亡与肿瘤之间的关系也逐渐成为人们研究的热点。研究认为,肿瘤的发生,是细胞增殖与细胞凋亡平衡失调的结果。Twist基因是一种在胚胎发育过程中起关键调控作用的转录因子,是一种高度保守的碱性螺旋-环-螺旋(basic helix-loop-helix,bHLH)蛋白家族的重要成员。Twist基因广泛地参与了调控器官的生长发育、肿瘤发生、细胞增殖分化等过程。近年来研究发现,Twist基因也具有癌基因的特性,能够编码凋亡抑制蛋白,影响肿瘤细胞的凋亡,抑制细胞分化、诱导上皮-间质变(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的发生、参与肿瘤的耐药以及肿瘤血管的生成过程从而在肿瘤发生及侵袭转移过程中发挥重要的作用。EMT是在胚胎的发生过程、慢性炎症性疾病的发生过程以及肿瘤进展过程中的一个重要步骤,EMT的主要特征就是上皮细胞的极性丧失而获得了间质特性。肿瘤细胞发生EMT后能够获得更强的浸润和游走性,因此目前研究认为EMT现象与肿瘤浸润转移过程关系密切,当肿瘤细胞出现EMT时可以看作是浸润转移过程的开始。Twist基因是EMT过程的关键调控因子。有研究表明,在小鼠乳腺癌细胞株的体内外研究中发现Twist在肿瘤的转移阶段表达显著增强。也有研究表明: Twist基因在多种上皮细胞癌中过度表达,包括乳腺癌、胃癌、前列腺癌黑色素瘤以及骨肉瘤等。但是Twist基因在结肠癌的发生及浸润转移过程中如何发挥作用及其机制如何,目前国内外的研究报道还很少。我们在前期对结直肠癌组织中Twist基因的表达情况进行了研究:Twist基因在癌组织中的表达明显高于在正常组织中的表达。为了进一步深入研究Twist基因在结直肠癌发生发展中的作用,本课题从三部分对Twist基因对结肠癌细胞增殖、凋亡及侵袭能力的影响进行了研究:1.通过RT-PCR和Western-blot检测Twist mRNA和Twist蛋白在转移能力不同的人结肠癌细胞株中的表达情况2.通过基因转染方法上调体外培养的人结肠癌SW480细胞株的Twist基因的表达,观察上调Twist基因表达对癌细胞增殖、凋亡及侵袭能力的影响。3.通过siRNA干扰技术降低体外培养的人结肠癌HCT116细胞株的Twist基因的表达,观察下调Twist基因表达对癌细胞增殖、凋亡及侵袭能力的影响。第一部分Twist基因在转移能力不同的结肠癌细胞株中表达情况的研究目的:检测Twist基因在转移能力不同的结肠癌细胞株中的表达情况,区分出高表达及低表达Twist基因的细胞株,为以后深入研究Twist基因对结肠癌细胞株增殖、凋亡及侵袭能力的影响奠定基础。方法:1运用RT-PCR方法检测Twist mRNA在结肠癌细胞株SW480,SW620及HCT116中的表达情况。2运用Western-blot方法检测Twist蛋白在结肠癌细胞株SW480,SW620及HCT116中的表达情况。3统计学分析运用SPSS 13.0软件,数据以均数±标准差((X|-)±S)表示, P<0.05为差异有统计学意义。结果:1转移能力不同的结肠癌细胞系中Twist mRNA的表达情况RT-PCR结果显示:HCT116、SW620、SW480三种结肠癌细胞株中的Twist mRNA表达量分别为0.985±0.015、0.506±0.020、0.445±0.025。在高转移HCT116细胞中的Twist mRNA表达量显著高于其它两株,组间差异有统计学意义(P<0.05)。在转移能力较低的SW620细胞及SW480细胞中的表达均较低,两组间差别无统计学意义(P﹥0.05)。2转移能力不同的结肠癌细胞系中Twist蛋白的表达情况Western-blot结果显示:HCT116、SW620、SW480三种结肠癌细胞株中的Twist蛋白的表达量分别为1.488±0.060、0.751±0.022、0.651±0.030。在高转移HCT116细胞株中Twist蛋白的表达量显著高于其它两株,组间差异有统计学意义(P<0.05)。在转移能力较低SW620细胞及SW480细胞中表达均较低,两组间差别无统计学意义(P﹥0.05)。结论:Twist基因在三种转移能力不同的人结肠癌细胞系中的表达量不同,其中在高转移结肠癌HCT116细胞株中存在高水平的表达,而在转移性较低的SW480及SW620细胞株中低水平表达,表明Twist基因表达量的高低与肿瘤细胞的类型和同类细胞恶性程度的不同有关,呈现转移能力越强、表达越高的趋势。第二部分上调Twist基因对人结肠癌SW480细胞增殖、凋亡及侵袭能力影响的研究目的:将高表达Twist基因的质粒稳定转染低表达Twist基因的人结肠癌SW480细胞,体内外实验评价上调Twist基因的表达对SW480细胞增殖、凋亡及侵袭能力的影响。方法:用高表达Twist基因的质粒对人结肠癌SW480细胞进行转染,用RT-PCR和western-blot鉴定转染结果,经G418筛选得到稳定转染Twist基因的细胞。通过MTT法,观察转染后肿瘤细胞增殖情况的变化,通过细胞划痕实验和Matrigel侵袭实验观察转染后肿瘤细胞体外迁移能力和侵袭能力的变化。将肿瘤细胞接种至裸鼠皮下,观察对比转染前后肿瘤细胞在裸鼠体内的成瘤情况。结果:1RT-PCR和Western-blot方法检测转染效果结果显示:稳定转染Twist基因的SW480细胞中Twist mRNA和Twist蛋白表达量均显著高于未转染组(P<0.05)。2上调Twist基因对细胞体外增殖的影响通过MTT法检测细胞活性并且绘制细胞生长曲线,结果显示,从第4天开始,转染Twist基因的SW480细胞生长速度明显高于对照组(P<0.05)。3上调Twist基因对细胞周期的影响FCM检测细胞周期结果显示:转染Twist基因后SW480细胞的增殖指数(PI=61.279±1.709%)和S期细胞比例(33.171±3.154%)均明显高于对照组(PI=26.142±1.518%;14.112±2.137%,P<0.05)。提示转染Twist基因可明显增加SW480细胞的体外增殖活性。4上调Twist基因对细胞体外迁移能力的影响通过细胞划痕实验显示,划痕24小时后转染组细胞迁移率为(40.06±5.56)%明显高于对照组(25.24±2.65%,P<0.05)差异有统计学意义。48小时后,转染组细胞迁移率(75.77±8.06)%仍明显高于对照组(35.37±6.79%,P<0.05)差异有统计学意义。提示上调Twist基因可显著提高SW480细胞的体外迁移能力。5上调Twist基因对细胞体外侵袭能力的影响Matrigel侵袭实验结果显示,转染Twist基因的SW480细胞发生侵袭的个数为(154±12),未转染组细胞侵袭个数为(73±14),提示上调Twist基因可显著提高SW480细胞的侵袭能力(P<0.05)。6上调Twist基因对细胞凋亡的影响FCM结果显示:转染组的细胞凋亡率为:(6.831±1.624)%,对照组细胞凋亡率为(12.223±1.733)%,转染组凋亡率显著低于对照组,二者差异有统计学意义(P<0.05)。提示上调Twist基因可降低SW480细胞的凋亡率。7上调Twist基因对结肠癌SW480细胞裸鼠皮下移植瘤成瘤性的影响接种转染组和对照组细胞的裸鼠,在接种后大约16天左右可见肿瘤结节,转染组肿瘤体积约1.804±0.419cm~3,对照组肿瘤体积约0.636±0.228 cm~3,转染组肿瘤体积显著大于对照组,二者差异有统计学意义(P<0.05)转染组肿瘤称重约为6.435±0.421g,对照组肿瘤称重为3.357±0.325g,转染组肿瘤显著重于对照组,两者差异有统计学意义(P<0.05)。结论:1通过本实验Twist基因成功转入SW480细胞株并且呈稳定表达。2上调Twist基因表达可显著提高SW480细胞体外增殖能力。3上调Twist基因表达可显著增加SW480细胞体外迁移能力和体外侵袭能力。4上调Twist基因表达可以明显降低SW480细胞凋亡率。5在体内实验结果表明,转染Twist基因对SW480细胞成瘤率无明显影响,但转染组细胞移植瘤的体积和质量均明显大于对照组,进一步验证了Twist基因对SW480细胞体内增殖能力的促进作用。第三部分下调Twist基因对人结肠癌HCT116细胞增殖、凋亡及侵袭能力影响的研究目的:观察下调Twist基因的表达对人结肠癌HCT116细胞增殖、凋亡及侵袭能力的影响方法:应用siRNA技术下调Twist基因的表达,用RT-PCR和western-blot鉴定干扰结果,经G418筛选得到稳定表达的细胞株。通过MTT法,观察干扰后肿瘤细胞增殖情况的变化,通过细胞划痕实验和Matrigel侵袭实验观察干扰后肿瘤细胞体外迁移能力和侵袭能力的变化。将肿瘤细胞接种至裸鼠皮下,观察对比干扰前后肿瘤细胞在裸鼠体内的成瘤情况。结果:1 RT-PCR和Western blot检验干扰效果结果显示:干扰组细胞中Twist mRNA和Twist蛋白表达量均显著低于对照组(P<0.05)。2下调Twist基因的表达对HCT116细胞体外增殖的影响通过MTT法检测细胞活性并绘制细胞生长曲线,结果显示,从第4天开始,干扰组细胞生长速度明显低于对照组(P<0.05)。提示下调Twist基因能够明显降低HCT116细胞的体外增殖能力。3下调Twist基因的表达对HCT116细胞周期的影响FCM检测细胞周期结果显示:下调Twist基因后干扰组HCT116细胞的增殖指数为(PI=28.989±1.795%)和S期细胞比例(15.818±2.115%)均明显低于对照组(PI=57.333±1.627%;30.318±3.137%,P<0.05)。提示下调Twist基因的表达可明显降低HCT116细胞的增殖活性。4下调Twist基因的表达对HCT116细胞体外迁移能力的影响通过细胞划痕实验显示,划痕24小时后干扰组细胞迁移率为(15.06±2.56)%,明显低于对照组(25.24±1.65%,P<0.05 P<0.05)。48小时后,干扰组迁移率为(25.77±4.06)%仍显著低于对照组(45.37±6.79%,P<0.05)。提示下调Twist基因的表达可显著降低HCT116细胞的体外迁移能力。5下调Twist基因的表达对HCT116细胞体外侵袭能力的影响Matrigel侵袭实验结果显示,干扰组HCT116细胞发生侵袭的个数为(68±18),对照组细胞发生侵袭的个数为(123±20),提示下调Twist基因的表达可明显降低HCT116细胞的体外侵袭能力(P<0.05)。6下调Twist基因对结肠癌HCT116细胞凋亡的影响FCM检测细胞凋亡结果显示:干扰组的细胞凋亡率为(30.652±3.644)%,对照组细胞凋亡率为(10.423±3.506)%,干扰组细胞凋亡率显著高于对照组,二者差异有统计学意义(P<0.05)。提示下调Twist基因的表达可以提高HCT116细胞的凋亡率。7 Twist基因对结肠癌HCT116细胞裸鼠皮下移植瘤成瘤性的影响接种干扰组和对照组细胞的裸鼠,在接种后大约12天左右可见肿瘤结节,54天后处死两组裸鼠,解剖并仔细观察,两组均未见肿瘤有远处转移。干扰组肿瘤体积约0.836±0.218 cm~3对照组肿瘤体积约1.814±0.257cm~3,,干扰组肿瘤显著小于对照组,二者差异有统计学意义(P<0.05)。干扰组肿瘤称重约为3.637±0.225g对照组肿瘤称重为6.530±0.420g,干扰组肿瘤显著低于对照组,两者差异有统计学意义(P<0.05)。.结论:1本实验方法能成功下调人结肠癌HCT116细胞株中Twist基因的表达。2下调Twist基因表达可以显著降低HCT116细胞的体外增殖能力。3下调Twist基因表达能够显著降低HCT116细胞的体外迁移和侵袭能力。4下调Twist基因表达能够显著提高HCT1160细胞的凋亡率。5在体内实验结果表明,下调Twist基因表达对HCT116细胞成瘤率无明显影响,但是干扰组细胞移植瘤的体积和质量均明显小于对照组,进一步验证了下调Twist基因对HCT116细胞体内增殖的抑制作用。