论文部分内容阅读
谷氨酰胺转氨酶(Transglutaminase, EC 2.3.2.13,简称TGase)能催化蛋白质分子内、分子间发生酰基转移反应,从而改变蛋白质结构和功能特性,在食品、生物医药、组织工程、纺织等领域具有广泛的应用前景。链霉菌TGase是酶原(Pro-TGase)经活化而成的,但是关于链霉菌TGase的活化机理还不清楚。为了深入地研究吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)产TGase的活化机理,本论文对S. hygroscopicus发酵产生的Pro-TGase和TGase的高效分离纯化及TGase的活化过程进行了研究。主要研究结果如下：1.在培养基中分别添加不同浓度的Cu2+, Mn2+, Zn2+, Fe2+, Co2+五种金属离子,摇瓶发酵培养发现,Cu2+, Mn2+, Zn2+对S. hygroscopicus产TGase有明显的促进作用,并且确定0.05 mmol/L Cu2+是最适合添加的离子。确定了S. hygroscopicus利用优化培养基液体培养过程中,培养60 h时Pro-TGase可以完全转化成TGase。2.利用硫酸铵沉淀和阴离子交换层析以及凝胶过滤层析对S. hygroscopicus发酵上清液中的Pro-TGase和TGase进行了高效分离纯化,并得到两种活性较高而电荷量不同的TGase (TGase A和TGase B)。本研究是首次利用阴离子交换层析法对吸水链霉菌Pro-TGase和TGase分离纯化。3.通过Hiprep 16 10 phenyl FF柱和LC-MS以及CD谱对两种TGase的疏水性、天然相对分子质量以及二级结构进行分析,发现TGase A和TGase B的疏水性、相对分子质量和二级结构均存在差异。研究了两种TGase的动力学,发现两种TGase的Vmax、Km和Kcat差异也很大。4.测定了S. hygroscopicus来源的Pro-TGase的N端氨基酸序列为ASGGDG, TGase A和TGase B的N端前五个氨基酸序列均为DAADE。S.hygroscopicus来源Pro-TGase的N端氨基酸序列与已报道的S. cinnamoneus、S.fradiae、S. netropsis来源的相似性很高,但TGase的N端序列与这三种链霉菌来源的相似性却不高。本研究是首次对S.hygroscopicus来源的TGase的N端氨基酸序列进行报道。5.对纯化后的Pro-TGase与TGase A和TGase B的相互作用进行研究发现,Pro-TGase可以被自身的TGase B活化但不能被TGase A活化。热处理后的Pro-TGase对TGase A和TGase B的活性均有抑制作用,而且对TGase B的抑制作用更显著。本研究是首次对S. hygroscopicus来源的Pro-TGase可以被自身的TGase活化进行报道。6.分别对不同培养时间点的发酵液进行分离纯化,发现了TGase的活化机理：S.hygroscopicus经过24 h的培养后Pro-TGase被分泌到胞外,一部分Pro-TGase经胞外的活化蛋白酶切割成为成熟的TGase B; TGase B也具有活化自身的Pro-TGase的功能,被切去酶原区的部分空间结构发生变化,生成性质不同的TGase A。