由鲤春病毒血症病毒(Spring Viremia of Carp virus,SVCV)引起的鲤春病毒血症(Spring Viremia of Carp,SVC)是一种急性且致命的鱼类传染病。该病的主要特点是发病急且死亡率高,目前并无有效的治疗方法,严重威胁水产养殖业的经济发展。热应激蛋白家族(Heat Shock Proteins,HSPs)是生命体处于应激状态时,机体为维护体内正常生理功能而产生的一类伴侣蛋白。宿主体内的热应激蛋白不仅在胚胎发育、信号传导、抗氧化、抗应激、抗细胞凋亡等方面有明显的调节功能,在协同免疫方面也发挥着重要作用。因此本研究首先通过蛋白组学筛选出SVCV感染鲤鱼上皮瘤细胞(EPC)后表达差异显著的蛋白。以此为基础克隆EPC源的HSP47基因序列并进行生物学分析,同时设计siRNA构建HSP47基因沉默EPC细胞,以SVCV为外源病毒进行感染。探讨SVCV在正常EPC,HSP47过表达EPC与HSP47基因沉默EPC中的复制能力。为科研工作者探讨SVCV的致病机理与宿主自身蛋白的抗病毒免疫反应提供一定依据。1.与SVCV相互作用的宿主蛋白的筛选与分析蛋白组学结果显示SVCV感染组与空白组共有35个显著差异性的蛋白,其中包含19个显著上调和16个显著下调的蛋白。其中ATPase和PSMC2等表达显著上调,而HSP70和HSP47等表达下调。差异细胞蛋白主要集中在生物过程、细胞组成以及分子功能等方面。本章节首次从EPC细胞中克隆出HSP47基因序列:全长1209bp,共编码304个氨基酸,通过序列同源性比对发现EPC细胞源的HSP47与鲤鱼和鲫鱼亲缘关系最近。与智人、小鼠和斑马鱼的蛋白同源性分别是63.88%、64.35%和87.8%。2.过表达宿主HSP47基因对SVCV复制的影响本章以SVCV易感细胞EPC为实验对象,通过使用DAPI染色观察SVCV感染后的细胞病变情况。显微镜下可以清晰的看到SVCV感染后EPC表面死细胞显著增多,在感染48h时开始出现大量空斑,在感染60h时细胞基本脱落丧失细胞活性。荧光定量结果显示SVCV-G的基因表达量随感染时间的增加而显著增加,在48h时表达量呈直线式增长。与之相反的是随着SVCV感染时间的增加,HSP47基因的表达量呈下降趋势,在24h时显著下调,蛋白表达结果与基因一致。实验结果表明转染p CDNA3.1-His-GFP-HSP47质粒能使细胞HSP47蛋白表达量显著提高。当细胞转染过表达质粒之后,与SVCV感染组相比,过表达HSP47组的SVCV的病毒滴度和基因表达量显著下调。实验结果表明过表达宿主HSP47基因可以在一定程度上抑制病毒复制。3.RNA干扰HSP47后对SVCV复制的影响本章实验对正常及HSP47基因沉默的细胞分别进行病毒感染。通过流式细胞术检测病毒感染后的细胞凋亡率和坏死率,实验数据表明,HSP47干扰后的细胞凋亡率和坏死率显著提高。与对照组相比,RNA干扰EPC组的SVCV的病毒滴度和SVCV-G表达量显著上调。而阴性对照组与SVCV组结果差异不显著。与正常EPC组相比,SVCV感染可显著上调HSP47基因沉默组内的IFN-α,IL-1β和IL-10细胞因子的表达。同时上调细胞TLR3和IRF3的表达。实验结果表明干扰宿主HSP47基因不仅会影响到病毒的复制,同时对细胞的凋亡坏死以及细胞内相关因子的表达也产生一定的影响。