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目的:肺癌是全世界癌症死亡的主要原因之一,因此研究与肺癌发生以及进展相关的信号通路,及其作用机制,对延长肺癌患者的生存期、改善预后和选择治疗方案具有重要意义。ARHGEF40基因（Rho guanine nucleotide exchange factor 40）,也被称为Solo,Scambio,Quo,位于人类染色体14q11.1上,编码约181k Da的蛋白质,属于Rho GEFs家族中Dbl同源蛋白。ARHGEF40蛋白的结构域包括:一个N端的Solo结构域,一个CRAL/TRIO结构域、中心区域的SPEC结构域和C端的DH-PH结构域。其N端、中心区和DH-PH结构域与斑马鱼quattro蛋白同源,quattro蛋白参与肌动蛋白细胞骨架介导的形态发生运动。在进一步研究中,ARHGEF40在机械力存在的情况下,通过协助F-actin定位以及激活Rho A,促进血管内皮细胞重新定向。另外,ARHGEF40通过与k8/k18结合,促进外力作用下细胞骨架的强化,其中ARHGEF40的N端的Solo结构域具有角蛋白结合能力,对其在细胞力学转导中的作用至关重要。目前为止,ARHGEF40在肿瘤中的生物学功能尚无文献报道。因此,ARHGEF40在非小细胞肺癌中发挥哪种作用,通过哪种途径实现,这些都是我们感兴趣的问题。本研究旨在探讨ARHGEF40在非小细胞肺癌（NSCLC）中的表达情况与临床病理因素之间的关系;探讨ARHGEF40对肺癌细胞增殖、侵袭能力的影响及其作用机制。研究方法:通过免疫组化,免疫印迹和Kmplot网站分析证实ARHGEF40与非小细胞肺癌患者的临床病理因素之间的关系。在转染和敲除ARHGEF40的肺癌细胞系中,进行细胞功能学实验证明ARHGEF40对于非小细胞肺癌增殖和侵袭能力的影响。在肺癌细胞中进行转染、敲除ARHGEF40和加入抑制剂LY294002或转染Rho A失活突变体N19Rho A,通过PCR、荧光素酶报告基因、免疫印迹研究ARHGEF40影响肺癌发生发展的可能机制。最后通过剪接体证实DH-PH结构域在ARHGEF40参与非小细胞肺癌病理生理过程中的作用。结果:1.ARHGEF40的表达水平与NSCLC患者的临床病理因素相关。免疫组化显示:在NSCLC组织中,ARHGEF40在细胞质内高表达,并且显著高于癌旁正常肺组织。ARHGEF40高表达与肺癌患者的TNM分期和淋巴结转移呈正相关。免疫印迹结果显示:肺癌组织中,ARHGEF40蛋白表达高于癌旁肺组织。Kaplan-Meier分析显示:高表达ARHGEF40的肺癌患者生存期缩短。细胞免疫荧光证实:ARHGEF40在非小细胞肺癌细胞A549和H1299中定位于细胞质。2.ARHGEF40促进非小细胞肺癌的增殖和转移。在A549细胞系中,过表达ARHGEF40能够促进细胞的增殖和侵袭。在H1299细胞系中,敲减ARHGEF40蛋白表达能够抑制细胞增殖和侵袭。3.ARHGEF40上调Wnt信号通路活性。在A549细胞系中过表达ARHGEF40,发现Wnt信号通路关键蛋白activeβ-catenin表达上调、磷酸化β-catenin表达下调,β-catenin下游靶基因c-Myc、cyclin D1、MMP-7在m RNA和蛋白水平表达上调,荧光素酶报告基因证明Wnt通路活性增强。在H1299细胞系中敲减ARHGEF40蛋白表达,发现Wnt通路关键蛋白activeβ-catenin表达下调、磷酸化β-catenin表达上调,β-catenin下游靶基因c-Myc、cyclin Dl、MMP-7在m RNA和蛋白水平表达下调,荧光素酶报告基因证明Wnt通路活性被抑制。在A549和H1299中转染ARHGEF40,细胞免疫荧光显示:β-catenin入核增加。在A549中转染ARHGEF40,核浆分离试验显示:β-catenin入核增加。4.ARHGEF40通过PI3K/AKT/GSK3β途径上调Wnt信号通路活性。在A549细胞系中过表达ARHGEF40,发现磷酸化AKT（473）、磷酸化GSK3β表达上调;在H1299中干扰ARHGEF40蛋白表达后,发现磷酸化AKT（473）、磷酸化GSK3β表达下调。在A549中过表达ARHGEF40后使用AKT通路抑制剂LY294002,发现磷酸化β-catenin表达上调,activeβ-catenin、磷酸化GSK3β随之表达下调,PCR和荧光素酶报告基因证明ARHGEF40促进Wnt通路活性的作用被抑制,细胞功能学实验证实ARHGEF40促进A549增殖和侵袭的作用被抑制。5.ARHGEF40能够与Rho A结合,并激活Rho A-AKT通路活性。通过在A549中转染ARHGEF40,发现ARHGEF40能结合并激活Rho A及其下游的AKT。通过在A549细胞中共转染ARHGEF40和Rho A突变失活体发现:activeβ-catenin、磷酸化GSK3β随之表达下调。PCR和荧光素酶报告基因证实,加入Rho A失活突变体后,ARHGEF40促进Wnt通路活性的作用被抑制。细胞功能学实验证实,加入Rho A失活突变体后,ARHGEF40促进A549细胞系增殖和侵袭的作用被抑制。6.DH-PH结构域参与Rho A的结合与激活。在以上实验结果的基础上,我们对ARHGEF40结构域进行了分析。我们构建了失去DH-PH结构域的ARHGEF40剪接体。在A549细胞转染ARHGEF40剪接体ΔDH-PH后,免疫印迹、荧光素酶报告实验及PCR实验表明ΔDH-PH剪接体不能激活Rho A及其下游通路。免疫荧光证实:ΔDH-PH不能使β-catenin入核增加。细胞功能学证实:ΔDH-PH不能促进A549的侵袭和转移。结论:1.ARHGEF40在NSCLC细胞质中表达,其高表达与NSCLC患者进展和不良预后相关。2.上调ARHGEF40促进肺癌细胞的增殖和侵袭。3.ARHGEF40通过Rho A-AKT-GSK3β途径调节Wnt信号通路活性,其中DH-PH结构是关键结构域。