蛋白激酶Stk38在抗病毒固有免疫反应中的作用机制研究

来源 :第二军医大学 | 被引量 : 2次 | 上传用户:bigtim1
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固有免疫(innate immunity)又称天然免疫(natural immunity),是机体本身具有的抵抗外来病原体入侵的防御能力。固有免疫应答由模式识别受体(Pattern recognition receptors,PRRs)对病原体中的相对保守成分的识别而启动。这些病原体中相对保守的成分被称为病原相关分子模式(Pathogen associated molecular Patterns,PAMPs),在病原体生存或致病过程中所必须。模式识别受体识别相应的配体之后,能够通过激活下游的信号分子,经一系列信号转导过程,引起炎症细胞因子和Ⅰ型干扰素等免疫介质的分泌,促进机体进行免疫应答反应。对病毒成分的识别和应答是固有免疫反应的重要组成部分。对病毒核酸成分的识别主要通过TLRs、RLRs和病毒双链DNA识别分子进行。TLRs是一类膜受体家族,其中TLR3、TLR7和TLR8存在于细胞内体膜上,可以识别内体中的病毒成分。病毒被吞噬之后,其核酸成分就会暴露在吞噬细胞的内体中,与相应配体结合后TLRs能够分别通过接头蛋白TRIF或MyD88,经下游信号转导分子,活化IRF3、IRF7和NF-κB,促进Ⅰ型干扰素和炎症细胞因子的分泌。RLRs主要负责对胞浆中病毒RNA成分的识别,包括RIG-I和MDA-5两种受体。病毒感染细胞后核酸成分进入胞浆,被RLRs识别。RLRs完成识别后活化,并招募接头分子MAVS,进一步激活下游的信号通路,磷酸化IRF3、IRF7和NF-κB,诱导Ⅰ型干扰素和炎症细胞因子产生。已发现的病毒双链DNA识别分子众多,主要通过接头蛋白STING激活下游的信号通路,磷酸化IRF3、IRF7和NF-κB,诱导Ⅰ型干扰素和炎症细胞因子产生。细胞分泌的Ⅰ型干扰素可以通过自分泌或旁分泌的方式与细胞膜上的Ⅰ型干扰素受体结合,活化与之偶联的酪氨酸蛋白激酶Jak1(Janus kinase 1)和Tyk2(tyrosine kinase 2),经Jak-STAT信号通路,激活下游大量干扰素诱导基因(IFN-stimulated genes,ISGs)的转录。从而增强机体抗病毒能力,同时还可以再作用于模式识别信号通路,进一步促进Ⅰ型干扰素的产生,通过正反馈作用使细胞短时间产生足量Ⅰ型干扰素。而其中STAT1分子在该通路的活化中有重要作用。除受到上游干扰素信号的激活外,STAT1还可以在RIG-I活化后,经MAVS非依赖的信号直接磷酸化激活,发挥作用。由以上Ⅰ型干扰素分泌的信号网络的复杂性可以看出,对Ⅰ型干扰素分泌的调控也是一个十分复杂的体系。Ⅰ型干扰素分泌的调控机制一直是固有免疫领域研究的热点问题,对其深入研究也有利于我们更好地了解抗病毒固有免疫应答机制,并寻找感染性疾病的潜在治疗策略。丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶38(Serine/threoninekinase38,Stk38),是NDR蛋白激酶家族的成员。其作为一种新型的Hippo信号通路蛋白激酶,在细胞生命活动中有广泛的生物学功能。我们通过前期研究发现,Stk38分子可以促进Smurf1介导的MEKK2的泛素化降解,负向调控TLR9介导的炎症反应,参与固有免疫应答。但其在抗病毒固有免疫领域是否有调控作用尚未见报道。本研究通过以下三个部分的内容,对以Stk38为代表的Hippo信号通路分子在抗病毒固有免疫应答中的调控机制展开研究。一、蛋白激酶Stk38对VSV诱导的巨噬细胞中IFN-β的表达调控作用本部分我们主要通过实验探究Stk38分子对抗病毒固有免疫反应是否有调控作用。利用小干扰RNA技术,在小鼠原代腹腔巨噬细胞中转染特异性靶向Stk38分子的siRNA后,通过实时荧光定量pcr检测IFN-βmRNA表达水平,ELISA检测细胞上清中IFN-β的含量,我们发现VSV感染诱导的IFN-β的产生能力明显下降。类似地,在stk38基因敲除小鼠腹腔巨噬细胞中也发现,VSV感染后其IFN-β的产生能力严重受损。另一方面,我们通过药物筛选获得稳定表达外源性stk38分子的raw264.7细胞株,与对照细胞株相比,VSV感染后,stk38高表达细胞株IFN-β的分泌水平相应升高。另外,我们还利用实时荧光定量PCR技术检测了VSV感染后Stk38基因敲除小鼠腹腔巨噬细胞中VSV病毒的核酸成分。结果发现,与对照细胞相比,stk38缺陷细胞中病毒的核酸拷贝数增高,复制能力更强。我们还在stk38缺陷小鼠体内建立了VSV急性感染疾病模型。通过检测小鼠血清中IFN-β的分泌水平我们发现,急性VSV感染后,缺陷小鼠血清中IFN-β的分泌明显减少。同时,Stk38缺陷小鼠的生存率也低于同窝对照野生型小鼠。通过以上实验结果我们证实,Stk38对VSV诱导的巨噬细胞IFN-β的分泌具有正向调控作用,并能够抑制病毒的增殖,同时在体内对病毒感染小鼠也具有保护作用。二、Hippo信号效应分子YAP对VSV诱导的巨噬细胞中IFN-β的表达调控作用由于Stk38是Hippo信号通路的调节分子,因此本部分我们为了发现Stk38对IFN-β分泌的调控机制,设计实验探究Hippo通路的效应分子yap是否参与Stk38对IFN-β的表达调控作用。在小鼠腹腔巨噬细胞中stk38缺失导致YAP表达水平增高。但是转染yap分子的siRNA对细胞表达IFN-β的能力没有影响,显示YAP对IFN-β不存在调控作用。以上实验结果表明,Stk38分子对IFN-β的调控是通过YAP非依赖的方式进行的。三、Stk38分子调控VSV诱导的IFN-β表达的分子机制本部分主要内容为Stk38调控IFN-β表达的具体分子机制相关的实验结果。我们通过对干扰素相关信号通路活化情况的筛选发现,VSV感染诱导的Stk38缺陷细胞中干扰素相关通路信号分子STAT1的磷酸化水平降低,提示Stk38可能通过调节STAT1的活化水平调控IFN-β的产生。通过文献回顾寻找线索,我们发现糖原合酶激酶3(GSK3)分子对STAT1的活化具有正向调控作用。因此我们利用GSK3分子的小干扰RNA或特异性抑制剂CHIR-99021处理细胞,发现对GSK3分子的抑制确实能够降低VSV诱导的STAT1的活化和IFN-β的表达。同时,在HEK293细胞中转染相关分子的高表达载体,我们发现Stk38分子可以与GSK3分子结合,通过阻断Akt对GSK3磷酸化修饰的机制,对GSK3的活性起到保护作用。最后,CHIR-99021能够阻断Stk38分子对STAT1活化和IFN-β表达的促进作用。我们通过本部分实验,初步证明Stk38可以通过调节GSK3-STAT1信号,促进VSV感染诱导的IFN-β的合成和分泌。综上所述,我们通过实验证实,Hippo信号通路新型蛋白激酶Stk38可以通过GSK3-STAT1信号途径,促进VSV感染诱导的IFN-β的合成和分泌。我们的研究首次发现Stk38分子在抗病毒固有免疫应答中具有调控作用,并初步探讨了其作用机制,提出Stk38分子能够通过与GSK3分子的相互作用,并经GSK3-STAT1信号促进IFN-β分泌,增强机体抗病毒的能力。对Stk38调控IFN-β分泌机制的发现,一方面进一步丰富了Stk38的生物学作用,使对该分子的功能有了新的认识;另一方面也对抗病毒固有免疫应答调控的信号网络有了部分拓展,为IFN-β分泌的调控机制研究提供了新的思路;另外,为病毒感染性疾病的治疗提供了一个潜在的新靶点。
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