免疫学领域近来发现了一组新的固有淋巴样细胞（ILCs）,其缺乏特异性受体并且能够独立于抗原呈递而被活化。根据转录因子的表达和细胞因子的产生,ILCs可分为三个亚群:ILC1,ILC2和ILC3。ILC1表达T-bet并产生IFN-γ和TNF-α,ILC2 表达 GATA-3 并产生 IL-4,IL-5 和 IL-13,ILC3 表达 RORyt 并产生IL-17和IL-22。ILCs的不同亚群对于维持生理过程中的体内稳态,诱导炎症和损害以及促进病理状态下的组织恢复至关重要。ILCs除了在肺、肠道、皮肤等粘膜屏障中富集外,还在外周实质性脏器中广泛存在,如肝脏、肾脏等,已被发现在多种炎症性疾病中发挥重要作用。慢性肾脏病（Chronic kidney disease,CKD）的发病率及病死率逐年增长,已成为威胁全球的卫生健康问题。免疫细胞在肾脏疾病中发生明显变化,并且在疾病发生、进展、免疫监视和组织修复等多个过程中扮演重要角色。持续的炎症状态被认为是CKD的关键因素,并且与这些患者的全因死亡率明显相关。CKD中炎症的特征在于固有免疫和适应性免疫的改变,尤其是循环中活化的单核细胞和T细胞等。ILCs已经被证实多种炎症性疾病中至关重要,并且在循环和许多器官中发现,包括肾脏。并且我们既往的研究发现ILCs亚群在肾脏疾病动物模型中独特的作用及它们的治疗潜力。然而,在肾脏疾病的临床研究中关于ILCs的研究甚少。因此,明确ILCs及其亚群在CKD患者中的变化,ILCs及其各亚群与各种反映疾病活动的临床指标的关系,是值得深入探讨的课题。动物模型的研究中发现,ILCs的不同亚群对于维持生理过程中的体内稳态,诱导炎症和损害以及促进病理状态下的组织恢复至关重要。随着对ILCs的深入研究发现,在肾脏稳态及疾病中所发挥的作用也不可忽视。既往的研究中发现,ILC2在急性和慢性肾病动物模型中通过激活调节性免疫细胞和产生双调蛋白来调节炎症反应、防止肾脏功能障碍;此外研究发现在抗肾小球基底膜（anti-GBM）肾小球肾炎模型中,肾脏ILC1促进肾小球肾炎的发展。最近,一类新的ILC细胞亚群在肠道中被发现,并且在肠道炎症疾病模型中数量明显增加,可以通过分泌IL-10抑制肠道内的ILC1和ILC3分泌效应细胞因子,减轻肠道炎症8,这类具有免疫调节作用的ILC细胞亚群被命名为调节性固有淋巴细胞（ILCreg）。然而ILCreg在肾脏生理和病理状态中是否表达,表型情况以及是否具有生物学功能尚无人报道,有待明确,探讨该群细胞是否在肾脏组织中表达及其功能,对于寻找治疗肾脏疾病的新靶点有重要的意义和价值。目的1.通过检测不同类型的肾小球疾病患者及健康对照者外周血中总ILC细胞和各亚群ILC的变化,分析外周血ILCs与患者临床指标及各种类型CKD患者如:狼疮性肾炎（Lupus nephritis,LN）,糖尿病肾脏疾病（Diabetic kidney disease,DKD）等中反映疾病活动程度及肾脏疾病程度临床指标的相关性,初步评估CKD患者是否存在ILC细胞的异常,外周ILCs是否与CKD存在相关性;2.通过检测人和小鼠肾组织中ILCreg细胞的比例及表型,初步鉴定ILCreg细胞在肾脏的分布和表型;3.通过体外诱导扩增的ILCreg细胞分别与ILC1细胞和M1巨噬细胞共培养,探讨ILCreg细胞对固有免疫的调节机制;4.采用IL-2/IL-2抗体复合物在肾IRI模型小鼠体内诱导扩增ILCreg细胞,过继回输ILCreg细胞至模型小鼠体内,及抗体特异性清除ILCreg细胞,通过检测肾脏功能、损伤、炎症水平、炎性细胞浸润、细胞凋亡及增殖等指标,探讨ILCreg细胞在肾脏IRI疾病中发挥的作用;5.采用过继回输体外扩增后的ILCreg细胞至肾IRI模型小鼠体内,通过检测炎症细胞因子水平、炎症细胞浸润及巨噬细胞的表型,探讨ILCreg细胞通过减轻炎症细胞浸润、抑制固有免疫影响肾脏IRI病程的机制。方法1.按照纳入及排除标准选取CKD患者,留取患者外周静脉血标本,检测外周血单个核细胞中的总ILC细胞及各ILC亚群。送检肾功能、甘油三酯、血清白蛋白检测,留取24小时尿及晨尿送检,记录24小时尿量,检测24小时尿蛋白定量（total urine protein excretion rate,UPER）、尿白蛋白/肌酐比率（albumin-creatinine ratio,ACR）;eGFR采用CKD-EPI公式计算得出。另DKD患者记录身高、体重,检测空腹血糖、糖基化血红蛋白（glycated haemoglobin,HbA1C）;LN患者检测血常规、补体（complement component 3,C3）。2.雄性C57BL/6小鼠和Rag-/-和IL-10-GFP小鼠成年小鼠,体重20-25g,建立肾脏缺血再灌注损伤（ischemia reperfusion injury,IRI）模型小鼠。3.流式鉴定肾脏ILCreg细胞的比例和表型;流式分选出肾ILCreg细胞,建立ILCreg细胞体外扩增方案。4.ILCreg细胞与ILC1s和M1型巨噬细胞体外共培养,ELISA检测ILC1及M1型巨噬细胞分泌的效应细胞因子如IFN-γ,IL-1β和TNF-α的水平。5.采用IL-2/IL-2抗体复合物预处理或抗CD25抗体特异性清除肾IRI模型体内诱导ILCreg细胞,及体内回输ILCreg细胞的方法,通过PAS染色观察肾小管损伤,TUNEL检测肾小管细胞的凋亡程度,Ki67染色检测小管细胞增殖,流式细胞仪检测肾脏组织中ILCreg、ILC1、ILC2、ILC3s的比例。6.采用过继回输体外扩增后的ILCreg细胞至肾IRI模型小鼠体内,通过PAS染色观察肾小管损伤,TUNEL检测肾小管细胞的凋亡程度,Ki67染色检测小管细胞增殖,流式细胞仪检测肾脏组织中ILCreg细胞的比例;流式分选巨噬细胞,采用real-time PCR检测诱导型一氧化氮合酶（iNOS）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）,白细胞介素（IL）-1β、CC趋化因子配体2（CCL2）和甘露糖受体（MR）、精氨酸酶、血红素加氧酶-1（HO-1）和IL-10 mRNA的表达。7.数值变量指标的描述性统计如服从正态分布的变量用均数±标准差表示,否则用中位数和全距表示,肾功能指标为连续性变量采用均数±标准差表示,并进行对数转换以稳定方差,两组独立样本采用双尾t检验,如果方差不齐情况下使用welch校正,多组样本比较采用单向方差分析,并使用Tukey法进行多重两两比较。相关分析中Pearson相关分析用于参数检验,Spearman相关分析用于非参数检验。统计分析采用 Prism version 8（GraphPad Software,San Diego,CA）统计软件进行分析。校验水准α=0.05。结果1.按照纳入标准及排除标准,纳入CKD患者82例患者及16例健康对照人群（HC）纳入该研究,其中包括IgAN（IgA nephropathy,IgAN）患者21例,MN（membranous nephropathy,MN）患者11例,LN（Lupus nephritis,LN）患者 28例和 DKD（diabetic kidney disease,DKD）患者 22 例,其中 41例为男性。与 HC组相比,DKD组患者的总ILC细胞显著升高,且有显著统计学差异（P＜0.001）,而MN、IgAN患者中总ILC细胞比例差异无统计学意义。DKD和LN患者中ILC1s占CD45+淋巴细胞比例较HC组相比显著增多,有统计学差异。DKD患者中ILC2s占CD45+淋巴细胞比例显著增多,且有统计学差异（P＜0.05）,但在其他组别中未见明显变化。2.在LN患者中,总ILCs和ILC1占CD45+淋巴细胞比例在活动期LN患者中显著升高,差异有统计学意义;ILC2s和ILC3s则在两组间无明显差异。总ILCs和ILC1s占CD45+淋巴细胞比例与C3水平和WBC计数呈负相关,ILCs的比例与蛋白尿定量呈正相关。在DKD患者中,总ILCs和ILC1s占CD45+淋巴细胞比例与BMI,HbA1c呈正相关,总ILCs,ILC1s和ILC2s占CD45+细胞的比例与eGFR呈正向相关,总ILCs与ACR同样呈正相关,ILC3s占CD45+淋巴细胞比例与BMI和ACR呈正相关。纳入研究的所有CKD患者中,总ILC和ILC1占CD45+淋巴细胞比例与eGFR呈负相关,与ACR水平呈正相关。相反,ILC2s和ILC3s在CD45+淋巴细胞与反应肾脏功能的临床指标未见显著相关。3.Lin-CD127+CD161+IL-10+细胞被定义为人ILCreg细胞,约占总肾脏ILCs的4.4%。人肾脏组织中的ILCreg细胞表达IL-2高亲和力的受体CD25和T细胞诱导的共刺激分子,但是缺乏ILC2的标记CRTH2和KLRG1。Lin-CD127+CD90+IL-10+细胞定义为小鼠肾脏ILCreg细胞,约占总肾脏ILCs的2.7%。小鼠肾脏ILCreg细胞表达CD25和ICOS,但缺乏ILC2细胞特征性标记ST2 和 KLRG1。4.将IL-10-GFP小鼠肾组织中分选纯化出ILCreg细胞,分别加入IL-2,IL-7和TGF-β孵育3、6、12天。对不同组别中各时间点ILCreg细胞进行细胞计数。加入不同细胞因子进行刺激后,ILCreg细胞数量随时间延长均出现了增长,其中IL-2+IL-7+TGF-β组较其他组中ILCreg细胞在第3、6、12天时均明显增多,差异有统计学意义,细胞培养第12d时较扩增实验开始时增加＞40倍。扩增后的ILCreg仍然保留了特征的膜表达关键标记物和转录因子,包括CD127,CD90,CD25,ICOS和Id3。体外扩增后的ILCreg细胞分别按照不同的细胞密度比例进行共培养,并与只有ILC1细胞和ILCreg细胞的阴性对照组进行比较,培养体系共维持3天,检测不同组别培养上清液中IFN-γ的水平,随着ILCreg细胞比例的增加,由活化的ILC1细胞分泌的IFN-γ水平越低。加入抗IL-10和TGF-β的中和抗体后,培养上清液中ILC1细胞分泌的IFN-γ水平明显升高,与未加入抗体相比,统计学有显著差异。扩增后的ILCreg细胞与M1巨噬细胞孵育,加或不加抗IL-10和TGF-β的中和抗体以阻断ILCreg细胞的抑制功能,结果显示:加入中和抗体后,培养上清液中M1型巨噬细胞分泌的TNF-α和IL-1β水平明显升高,与未加入抗体组相比,统计学有显著差异。5.采用IL-2/IL-2抗体复合物（IL-2C）预处理Rag-/-小鼠,发现肾脏中ILCreg细胞明显增多。经IL-2C预处理（IRI+IL-2C组）与单纯疾病模型（IRI+Vehicle组）可以改善肾脏功能,缓解肾脏损伤,采用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（dUTP）和Ki67染色检测IRI+IL-2C组小鼠肾小管上皮细胞的凋亡和增殖,发现与IRI+Vehicle组相比,细胞凋亡程度减轻,细胞增殖程度改善),肾脏IL-10+ILCreg细胞占总ILC细胞的比例在IRI+IL-2C组中明显增多。6.采用IL-2C预处理后再采用抗CD25抗体（PC61）清除小鼠体内的ILCreg细胞（IRI+IL-2C/PC61组）。结果显示,IRI+IL-2C/PC61组中由IL-2C干预后产生的改善肾脏功能、减少小管细胞损伤及凋亡、促进细胞增殖的保护作用被抵消,与单纯使用IL-2C干预的疾病模型组（IRI+IL-2C组）相比,肌酐水平、小管损伤评分、凋亡细胞、Ki67表达细胞的各项指标均有显著统计学差异。并且在给予PC61干预后,采用流式细胞分析显示IRI+PC61组相较IRI+Vehicle组、IRI+IL-2C/PC61相较IRI+IL-2C组,肾脏ILCreg细胞均明显减少。7.将体外扩增的ILCreg细胞在IRI模型建立前24小时（pre-ILCreg组）或模型建立后4小时（post-ILCreg组）过继转移到C57BL/6小鼠体内。pre-ILCreg和post-ILCreg组均提示与IRI组相比,肾小管损伤、血清肌酐水平、肾小管上皮细胞凋亡明显减轻,肾小管上皮细胞增殖明显。与IRI组相比,pre-ILCreg和post-ILCreg组中肾脏组织的炎症细胞因子TNF-α,IL-1β,IL-6和细胞趋化因子CXC趋化因子配体1（CXCL1）和CXC趋化因子配体2（CXCL2）均明显降低,Gr-1+的中性粒细胞浸润显著减少。pre-ILCreg和post-ILCreg组中巨噬细胞中M1型标记物,包括诱导型一氧化氮合酶,TNF-α,IL-1β和CCL2明显降低,但M2型标记物,包括甘露糖受体、精氨酸酶、血红素加氧酶-1和IL-10则明显升高。结论1.DKD患者中,外周血总ILCs和ILCs亚群发生率显著的变化,且与某些临床指标呈现良好的相关性。总ILCs,ILC1s的比例和BMI,HBA1c呈正向相关,ILC3s的比例与BMI及ACR浓度呈正向相关。2.LN患者中,外周血ILC1s的比例增加,ILC2s的比例减少。总ILCs和ILC1s的比例与反应疾病活动程度的临床指标（WBC和C3）有相关性。3.CKD患者中,外周血总ILCs和ILC1s与反应肾脏功能的临床指标（ACR和eGFR）显著相关。4.人类和小鼠肾脏组织中鉴定了ILCreg细胞,人类肾脏ILCreg细胞（Lin-CD 127+CD161+IL-10）,小鼠肾脏ILCreg 细胞（Lin-CD 127+CD90+IL-10+）。5.肾脏ILCreg细胞体外可抑制固有免疫反应,抑制M1型巨噬细胞和ILC1细胞。6.体内扩增或过继转移ILCreg细胞可减轻肾脏IRI模型肾脏损伤。7.ILCreg细胞通过IRI肾组织炎症细胞浸润、促进巨噬细胞M1向M2极化减轻肾脏损伤。