第一部分:外泌体miR-665在弥漫性大B细胞淋巴瘤中的作用及机制研究研究背景:弥漫性大B细胞淋巴瘤（Diffuse large B cell lymphoma,DLBCL）是最常见的非霍奇金淋巴瘤,其临床典型特征为全身无痛性淋巴结肿大,或结外部位迅速出现增大的瘤块。DLBCL是一种高度恶性和侵袭性的肿瘤。尽管研究显示R-CHOP等一线治疗已经显著改善临床治疗效果,但由于DLBCL患者具有高度异质性,对治疗反应及预后差异较大,目前仍有大约1/3的患者对该方案耐药或治疗有效后复发。因此,寻找可精准评估DLBCL预后的生物标志物,提高DLBCL患者的整体生存率具有重要的临床意义。外泌体（exosomes）是一种广泛分布于血清、唾液、尿液等体液中的纳米级囊泡（粒径30-150 nm）,其由细胞分泌并具有脂质双层结构。外泌体包含来源细胞特异性的脂质、蛋白质、核酸（DNA和RNA）,并可被其他细胞摄取参与细胞间的通讯。由于外泌体含有丰富的标记物及内含物,肿瘤细胞来源的外泌体已成为多种肿瘤诊疗和预后的有效标志物之一,在肿瘤的早期筛查和诊疗方面具有不可替代的作用,尤其是外泌体所包含的miRNA已逐渐成为某些疾病的高敏标志物。Has-miR-665是由染色体14q32.2含72个脱氧核糖核苷酸序列编码、加工后生成的miRNA。有大量研究发现miR-665与急性淋巴细胞白血病、肝细胞癌、胃癌、卵巢癌等多种肿瘤增殖、分化、凋亡、侵袭、迁移及化疗耐药相关。研究发现,miR-665在胃癌和卵巢癌细胞中能抑制细胞增殖、迁移和侵袭。而在乳腺癌细胞中,miR-665能促进细胞体内成瘤和肺转移。目前研究证实DLBCL患者血清中miR-665表达水平明显下调,但其在DLBCL外泌体中的作用及机制尚未有报道。因此,深入研究外泌体miR-665在DLBCL的作用及其分子机制,有助于识别新的生物标志物,并改善DLBCL患者的预后。研究目的:本研究拟通过检测DLBCL患者与正常对照血清外泌体miR-665的表达水平;分析miR-665表达水平与患者临床特征之间的关联性,揭示其在评估DLBCL进展以及预后方面的临床价值;通过体内体外实验阐明miR-665对DLBCL发生发展的作用及其潜在的分子机制。研究方法:1.DLBCL患者血清外泌体的分离与鉴定:通过超速离心法从血清中分离外泌体,并通过透射电镜观察提取外泌体的形态特征,Western Blotting检测外泌体标志蛋白的表达水平;2.DLBCL患者及健康对照血清外泌体miR-665表达水平测定:采用试剂盒从外泌体中提取RNA,通过实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（Real-time RT-PCR,RT-qPCR）检测miR-665表达水平,分析其与DLBCL患者临床特征之间的相关性;3.细胞转染:向 DLBCL 细胞株中转染 miR-665 mimics、miR-665 inhibitor 以及 LASP1 siRNA,分别通过RT-qPCR及Western Blotting实验检测细胞中miRNA-665和LASP1基因及蛋白表达水平;4.CCK-8法检测DLBCL细胞株上调或下调miR-665表达水平后的增殖活性;5.利用流式细胞仪采用Annexin V/PI法检测DLBCL细胞株上调或下调miR-665表达水平后的凋亡能力;6.利用Transwell侵袭实验分析DLBCL细胞株上调或下调miR-665表达水平后的侵袭能力;7.利用Western Blotting检测DLBCL细胞株上调或下调miR-665表达水平后的凋亡和侵袭相关蛋白表达水平;8.利用生物信息学方法预测miR-665分子可能调控的下游靶基因LASP1,利用RT-qPCR、Western Blotting实验检测miR-665分子表达变化对靶基因LASP1表达水平影响。9.双荧光素酶报告实验验证miR-665与下游靶基因LASP1结合作用:构建LASP1基因3’UTR区野生及突变型荧光素酶报告载体,检测miR-665上调后荧光素酶活性的改变。10.小鼠皮下荷瘤后,通过H＆E染色分析小鼠皮下荷瘤肿瘤组织病理结构,IHC法检测Ki-67表达水平,TUNEL法分析DLBCL细胞凋亡情况。研究结果:1.透射电镜结果显示分离的外泌体呈杯状形态、具有双层膜结构,Western Blotting结果表明分离的囊泡高表达外泌体标志分子CD63和CD81,提示成功从DLBCL患者血清中分离外泌体;2.RT-qPCR结果显示:DLBCL患者血清外泌体miR-665表达水平明显低于健康对照组（P＜0.05）;DLBCL患者血清外泌体miR-665表达水平与Ann Arbor分期、乳酸脱氢酶水平以及国际预后评分（International prognostic index,IPI）密切相关;而与性别、年龄、疾病亚型、B症状之间没有关联性;3.RT-qPCR及Western Blotting实验结果显示:细胞转染后分别在基因及蛋白水平成功验证了过表达miR-665、降低miR-665及敲低LASP1的转染效率;4.过表达miR-665可明显抑制DLBCL细胞增殖和侵袭能力,降低MMP-2和MMP-9表达水平,而降低miR-665表达水平可促进DLBCL细胞增殖和侵袭能力,增加MMP-2和MMP-9表达水平;5.上调miR-665表达水平可促进细胞凋亡,增强促凋亡因子cleaved Caspase-3和Bax表达,抑制抗凋亡因子Bcl-2水平;6.MiRcode database及Targetscan数据库预测miR-665下游靶基因LASP1,双荧光素酶报告基因实验显示:LASP1是miR-665下游靶基因,miR-665可下调LASP1表达水平;7.体内实验验证miR-665通过靶向调控LASP1抑制DLBCL肿瘤生长;研究结论:1.DLBCL患者血清外泌体miR-665水平较健康对照组明显降低;2.DLBCL患者血清外泌体miR-665水平与Ann Arbor分期、LDH水平、IPI评分相关,可作为潜在的预后评估标志物;3.过表达miR-665可抑制DLBCL细胞增殖和侵袭,促进细胞凋亡;4.LSAP1在DLBCL组织和细胞中高表达,miR-665主要通过调控其下游靶基因LASP1表达水平介导DLBCL发生发展;5.小鼠体内实验证实miR-665通过靶向调控LASP1抑制DLBCL肿瘤生长。第二部分:骨髓间充质干细胞来源外泌体miRNAs在弥漫性大B细胞淋巴瘤中的作用研究研究背景:DLBCL的病因非常复杂,除了目前已证实的发病风险因素如遗传特征、免疫系统失调、病毒感染、职业环境暴露等,肿瘤微环境也参与DLBCL的发生发展。骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cell,BMSCs）是一种来源于骨髓的具有自我更新、快速增殖、多方向分化潜能的多能干细胞。在肿瘤领域也发现BMSCs与肿瘤微环境的形成有关,且可与肿瘤细胞相互作用,影响其生长转移潜能,近年来也将BMSCs作为肿瘤治疗的潜在靶点之一。BMSCs也作为一种可分泌外泌体囊泡的细胞之一,但目前关于BMSCs来源外泌体在DLBCL中的作用还不清楚,本研究旨在鉴定发现与DLBCL发生发展相关的BMSCs来源外泌体miRNAs,为DLBCL的早期诊断以及预后评估寻找新的生物标志物。研究目的:本研究拟从BMSCs来源外泌体中筛选出与DLBCL发生和进展密切相关的miRNAs;并评价骨髓间充质干细胞来源外泌体miRNAs的临床价值;初步探究骨髓间充质干细胞来源外泌体miRNAs在DLBCL中的作用。研究方法:1.BMSCs来源外泌体的分离与鉴定:通过超速离心法分离外泌体,并通过透射电镜、纳米颗粒分析跟踪分析仪、Western Blotting对分离外泌体进行鉴定;2.TaqMan Advanced miRNA测序分析BMSCs来源外泌体miRNAs差异表达谱;3.RT-qPCR检测BMSCs来源外泌体miRNAs表达水平;4.CCK-8法和Annexin V/PI法检测DLBCL细胞系与BMSCs来源外泌体共培养后细胞活性和凋亡水平;5.Kaplan-Meier分析BMSCs来源性外泌体miRNAs表达水平与DLBCL患者生存之间的关系。研究结果:1.透射电镜显示:BMSCs源性外泌体呈典型杯状样结构,直径约为100 nm,表达外泌体特异性标志物CD63和CD81,成功从BMSCs细胞上清中分离外泌体;2.BMSCs来源外泌体可促进DLBCL细胞增殖,抑制细胞凋亡;3.从健康志愿者和DLBCL患者BMSCs外泌体中共筛选出83个差异表达miRNAs,其中82个miRNAs发生下调,1个miRNA发生上调;4.Kaplan-Meier 分析显示:DLBCL 患者中低 miR-126-3p、miR-22-3p、miR-223-3p 表达水平与预后不良密切相关。研究结论:1.BMSCs来源外泌体可促进DLBCL的发生及进展;2.BMSCs外泌体miR-126-3p、miR-22-3p、miR-223-3p可作为预测DLBCL预后的潜在生物学标志物。第三部分:基于生物信息学方法分析弥漫性大B细胞淋巴瘤CAR-T细胞治疗相关脑病综合征生物标志物研究研究背景:DLBCL是一种异质性很强的疾病,其发病机制错综复杂,尽管DLBCL总体治疗疗效较好,但仍有超过三分之一的患者会出现复发和和难治的情况,挽救化疗方案或接受造血干细胞移植是复发/难治DLBCL的一线治疗方案,但实际上只有一半的患者能成功接受移植,且3年后PFS仅为53%。尽管嵌合抗原受体 T 细胞免疫疗法（Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy,CAR-T）在治疗复发/难治性DLBCL展现出惊人的疗效,但其严重的毒副作用也大大限制了其广泛使用。CAR-T细胞疗法的临床毒副作用主要包括细胞因子释放综合征（cytokine release syndrome,CRS）和CAR-T细胞相关性脑病综合征（CRES）,早期识别具有最高神经毒性风险的患者可能为在出现严重神经毒性之前进行早期干预提供机会,本研究通过利用GEO数据库中基因芯片数据筛选与DLBCLCAR-T治疗神经毒性相关的差异表达基因,并通过进一步的GO富集分析、Pathway分析、KEGG通路分析、以及结合预后分析,进一步筛选用于预测CAR-T神经毒性的预测生物标志物。研究目的:筛选可预测CAR-T细胞治疗弥漫性大B细胞淋巴瘤神经毒性严重程度的生物标志物。研究方法:从 Gene Expression Omnibus（GEO）数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）中下载GSE153438基因芯片数据,利用R软件筛选低级别CRES患者（0-2级）与高CRES级别患者（3-4级）之间的基因差异表达谱（differential expression genes,DEGs）,差异表达倍数大于2倍,且P值＜0.05定义为差异表达基因。对筛选出来的差异表达基因进行Gene ontology（GO）富集分析、Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）分析、Cytoscape 软件分析 protein-protein interaction（PPI）蛋白相互作用,受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic,ROC）分析差异表达基因对CAR-T细胞治疗神经毒性的预测价值。研究结果:1.通过GEO数据库GSE153438微阵列数据集共筛选出51个与DLBCL患者CAR-T细胞治疗神经毒性相关的差异表达基因,其中25个上调基因、26个下调基因;2.GO基因注释分析结果显示差异表达基因主要富集在T细胞活化、白细胞粘附、细胞粘附作用等相关信号通路;3.KEGG信号通路分析提示差异表达基因主要富集在T细胞受体信号通路、细胞粘附分子、Epstein-Barr病毒感染相关分子;4.GSEA富集分析显示糖酵解信号通路与神经毒性严重程度显著相关,通过PPI分析筛选出中枢基因颗粒酶B（Granzyme B,GZMB）表达水平可预测CAR-T细胞治疗神经毒性;5.ROC曲线分析显示GSEA可有效预测DLBCL患者CAR-T细胞治疗神经毒性。研究结论:1.在接受CAR-T细胞输注之前,DLBCL患者T细胞活化和糖酵解途径与CAR-T治疗相关神经毒性显著相关;2.GZMB可作为预测CAR-T细胞治疗神经毒性的有效分子标志物之一。