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目的:前期研究结果显示大鼠骨髓间质干细胞(rat bone marrow mesenchymal stemcell,rMSC)能对顺铂诱导的肾损伤起到保护作用,本研究进一步探讨miR-146b在其中的作用及机制,评价miR-146b为急性肾损伤早期分子标志物的可能性。通过沉默miR-146b表达比较观察顺铂损伤条件下肾小管上皮(NRK-52E)细胞的生物学特性改变,阐明miR-146b调控的关键靶基因及相关下游通路,揭示miR-146b参与MSC对顺铂诱导的肾毒性保护作用的可能分子机制。 方法:体外实验研究分三组,正常组为常规培养的NRK-52E细胞,损伤组以7.5μM顺铂处理NRK-52E细胞6h后常规培养48h,rMSC组是在顺铂损伤后与rMSC共培养48h的细胞。PCNA免疫组织化学染色检测各组细胞增殖能力的差异,TUNEL检测细胞凋亡,Western Blot对比分析增殖凋亡相关蛋白的表达,综合判断rMSC对损伤的NRK-52E细胞的保护作用,通过荧光定量RT-PCR检测了各组细胞中miR-146b表达差异。以乱序序列为阴性对照(negative control,N.C.),顺铂损伤后的NRK-52E细胞转染miR-146b抑制剂(inhibitor),通过生长曲线、平板克隆形成实验及PCNA免疫组织化学染色检测细胞增殖能力,TUNEL-FITC比较细胞凋亡。利用TargetScan预测miR-146b靶基因,荧光素酶报告基因验证miR-146b对野生型预测靶基因erbB43非编码区(3UTR)特异性靶向作用。Western Blot检测N.C.和inhibitor组NRK-52E细胞中增殖凋亡相关蛋白、erbB4及其下游蛋白的表达。RT-PCR验证erbB4 siRNAs对其在mRNA水平的抑制作用,Westem Blot观察siRNAs对erbB4下游相关通路蛋白的影响。 体内实验以3mg/kg的顺铂剂量注射到大鼠腹腔,构建低剂量顺铂诱导的急性肾损伤模型。在顺铂注射后1-5d每天收集大鼠血清及肾脏标本,检测血清肌酐(Cr)、尿素(BU)及组织切片HE染色以评价肾功能,荧光定量RT-PCR检测血清及肾组织中miR-146b表达情况。Taq-man荧光定量RT-PCR检测hs-miR-146b-5p(miR-146b的人类同源性分子)在临床肾病患者及健康人血清中的差异表达。 结果:体外研究结果显示,rMSC能逆转损伤的NRK-52E细胞PCNA减弱趋势,并减轻受损NRK-52E细胞凋亡。顺铂使NRK-52E细胞内miR-146b表达上升(P<0.001),而在与rMSC共培养后又下调(P<0.01)。MiR-146b inhibitor能有效减少损伤后NRK-52E细胞中miR-146b表达,生长曲线分析、平板克隆形成实验均显示miR-146b表达抑制后能促进顺铂损伤后的NRK-52E细胞增殖,与PCNA免疫组织化学染色结果一致。结合文献报道,通过TargetScan预测miR-146b的靶基因中筛选获得erbB4。双荧光素酶报告基因分析验证了erbB4是miR-146b的直接靶基因。Western Blot结果表明miR-146b表达抑制的NRK-52E细胞中erbB4、PCNA及Bcl-2表达增高,同时erbB4下游蛋白raf1/2和erk1/2也发生上调。RT-PCR证明siRNA能有效抑制erbB4在mRNA水平的表达,Westem Blot显示erbB4 siRNA2转染的细胞中,erbB4直接下游蛋白stat5及mek/erk/c-myc表达均减弱。体内实验中,血清Cr及BU水平检测及肾组织切片HE染色结果表明,低剂量顺铂能诱导急性肾损伤。相较于Cr与BU,血清中的miR-146b能在顺铂处理1d时即有显著性高表达(P<0.05)。临床肾病患者血清中hs-miR-146b-5p较健康人表达水平较高(P<0.01)。 结论:体内外实验揭示顺铂诱导肾损伤过程中miR-146b表达上调,miR-146b可作为肾损伤的早期分子标志物。MiR-146b通过抑制erbB4及其下游通路蛋白从而抑制损伤的NRK-52E细胞增殖并促进凋亡发挥作用,而rMSC能降低miR-146b表达而对损伤细胞起到保护作用。