大肠杆菌O157:H7(Escherichia coli O157:H7)为一种危害严重的食源性致病菌,近20年来给世界各国带来了巨大影响。本文对其进行了微生物鉴定、定性和定量聚合酶链式反应(PCR)以及免疫学方法的检测技术的研究。 首先对其进行微生物学培养和检测,熟悉大肠杆菌O157:H7的基本生物学特性,并掌握用山梨醇麦康凯培养基(SMAC)初步鉴定O157:H7的方法。 其次,针对其特异性致病基因eae,stx等设计5对引物,进行常规的PCR检测,结果表明5对引物皆可以有效扩增且具有良好的特异性。通过优化试验确定其最适退火温度为58～60℃,反应的最佳引物浓度为2μmol/l。常规PCR检测大肠杆菌O157:H7的最低检测限为10~3cfu/ml。并主要对其中的引物a进行基于SYBRGreen Ⅰ染料的实时荧光定量(Real-time)PCR反应,结果也取得良好的扩增,最低检测限提高到lcfu/ml。在对Real-Time PCR进行了引物及模板浓度等的优化反应后,得出Real-time PCR标准曲线方程。 第三,通过动物试验得到大肠杆菌O157:H7的多克隆抗体,效价达到1:25000,建立的酶联免疫吸附试验(ELISA)最低检测限达到每个反应孔4.17x10~3cfu,且与其他大肠杆菌无交叉反应。