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研究目的探讨Gankyrin在大肠癌发生和发展过程中的作用及机制。研究方法1.收集于2004年1月-2008年1月在上海交通大学医学院附属第九人民医院就诊并于病理科存档的286例病人大肠组织石蜡标本。包括30例正常大肠上皮组织,3 0例低级别上皮内瘤变腺瘤组织(lowgrade intraepithelial neoplasia,LIN),3 0例高级别上皮内瘤变腺瘤组织(high-grade intraepithelial neoplasia,HIN),17 8例手术切除的原发性大肠癌及癌旁组织。免疫组化检测Gankyrin蛋白表达水平,统计学分析Gankyrin表达水平与大肠癌病人临床预后及生存期的关系。收集正常大肠上皮细胞和12个大肠癌细胞系,Western blot检测细胞系Gankyrin蛋白表达情况。2.为研究Gankyrin在大肠癌发生中的作用及机制,构建稳定过表达Gankyrin的小鼠胚胎成纤维NIH3T3细胞系,MTT比色实验和软琼脂集落形成实验分别检测过表达Gankyrin对细胞增殖和软琼脂集落形成的影响,Western blot检测Gankyrin功能可能相关的信号通路蛋白。应用裸鼠皮下成瘤实验,观察过表达Gankyrin NIH3T3细胞系皮下成瘤能力。HE染色、免疫组化和Western blot检测成瘤组织形态、Gankyrin和相关信号通路蛋白变化。为检测Gankyrin大肠癌发展中作用及机制,选取Gankyrin相对低表达的大肠癌细胞系SW620,LOVO,RKO,不同程度过表达Gankyrin,Western blot检测Gankyrin过表达对mTOR信号通路分子的的影响。构建持续稳定过表达Gankyrin的SW620、LOVO、RKO大肠癌细胞系,MTT比色实验和软琼脂集落形成实验分别观察过表达Gankyrin对大肠癌细胞系增殖和软琼脂集落形成的影响。建立大肠癌裸鼠皮下移植瘤模型,检测过表达Gankyrin对大肠癌皮下移植瘤生长的影响。免疫组化和Western blot方法检测成瘤组织中mTORC1信号通路分子的变化。为验证Gankyrin通过激活mTORCl促进肿瘤发生发展。将过表达Gankyrin的NIH3T3细胞系和大肠癌细胞系,给予mTORC1特异性抑制剂雷帕霉素,应用MTT比色实验和软琼脂集落形成实验,检测雷帕霉素能否完全阻断Gankyrin促进细胞增殖和恶性转化的能力。3.在TSC1/TSC2基因缺失的MEF细胞,转染Gankyrin siRNA,应用Western blot检测mTOR信号通路活性;在稳定过表达Gankyrin和稳定Knockdown Gankyrin的大肠癌细胞,应用Western blot技术检测TSC2和mTOR信号通路变化;应用cycloheximide(CHX)蛋白质合成抑制实验,检测Gankyrin对TSC2蛋白降解的影响。4.为进一步验证Gankyrin促进大肠癌恶性生长的作用,选取Gankyrin相对高表达的大肠癌细胞系SW480,DLD-1,HCT116,应用RNA干扰技术实现Gankyrin稳定Knockdown,MTT比色实验和软琼脂集落形成实验检测Gankyrin Knockdown对大肠癌细胞增殖和恶性生长影响。应用Gankyrin稳定Knockdown的大肠癌细胞系建立裸鼠皮下移植瘤模型,检测移植瘤生长和mTORCl底物P-S6S235/236、Ki67蛋白水平。建立人原代大肠癌裸鼠移植瘤模型(patient derived xenograft,PDX),传代后分组检测Gankyrin基因Knockdown对移植瘤生长和肿瘤组织mTORCl底物P-S6S235/236、Ki67、TSC2蛋白水平的影响。研究结果1.在正常大肠上皮组织、LIN、HIN,Gankyrin表达量依次升高。在大肠癌组织,Gankyrin的表达量与HIN相近。与正常大肠上皮细胞相比,Gankyrin在大肠癌细胞系中明显高表达;Gankyrin表达水平与病人的不良预后相关。2.Gankyrin过表达激活小鼠胚胎成纤维细胞NIH3T3的mTORC1信号通路,促进NIH3T3细胞增殖和软琼脂集落形成能力。Gankyrin过表达的NIH3T3细胞具有裸鼠皮下成瘤能力,成瘤组织内mTORCl信号通路高度活化。在Gankyrin低表达大肠癌细胞系SW620、LOVO、RKO,不同程度增加Gankyrin表达可以引起相应程度的mTORC1信号活化。Gankyrin过表达促进大肠癌细胞系的增殖和软琼脂集落形成能力。过表达Gankyrin促进大肠癌移植瘤生长,并激活mTORCl信号通路。给予mTORC1选择性抑制剂雷帕霉素,可以显著阻断Gankyrin引起的促NIH3T3和大肠癌细胞的恶性生长能力。3.Gankyrin过表达明显降低TSC2蛋白水平,激活mTOR信号通路,Knockdown Gankyrin明显上调TSC2蛋白表达,抑制mTOR信号通路活性;Knockdown Gankyrin明显延缓TSC2蛋白降解,延长TSC2蛋白半衰期;Gankyrin过表达明显促进TSC2蛋白降解,缩短TSC2蛋白半衰期。4.在体外和体内实验,包括与临床最为接近的patient-derived xenograft(PDX)动物模型。Gankyrin knockdown明显抑制大肠癌的生长,上调TSC2蛋白水平,抑制mTORC1信号通路的活性。研究结论Gankyrin在大肠癌中高表达并与不良预后相关,Gankyrin通过激活TSC2/mTORC1信号通路促进大肠癌的发生发展,抑制Gankyrin表达可以抑制大肠癌的生长。