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研究背景宫颈癌是第二常见女性肿瘤,是引起女性死亡的重要原因之一。宫颈癌早期通常表现隐匿,缺乏特异性,加上缺乏有效的筛查手段,发现时多为晚期。原位癌治愈率近100%,而Ⅳ期仅为10%,依赖于手术获得肿瘤的相关信息判断预后,尚无有价值的分子标记物。程序性细胞凋亡因子4(programmed cell death 4,PDCD4)是由Shibahara等发现的与细胞凋亡相关的基因,随后的多项研究显示PDCD4在多种肿瘤中的表达下调或缺失并且与肿瘤进程及不良预后相关。PDCD4是基因转录和蛋白翻译的抑制因子,能够抑制肿瘤的恶性行为,被认为是抑癌基因。而PDCD4在宫颈癌中的表达状态、功能尚未见报道,本研究的目的在于探究PDCD4在宫颈癌中的表达、作用和调控机制为PDCD4的临床应用提供理论依据和实验基础。第一章 PDCD4在宫颈癌组织中的表达及临床意义研究目的明确PDCD4在人宫颈癌组织中的表达及临床意义。材料与方法1.收集包括正常宫颈、宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasia,CIN)、原位癌(carcinoma in situ,CIS)和侵袭性宫颈癌(invasive cervical cancer,ICC)在内的宫颈锥切组织标本,和侵袭性宫颈癌患者经手术切除的新鲜癌及相应的癌旁组织。2.分别利用免疫组化和Western Blot的方法检测宫颈癌组织中PDCD4蛋白的表达情况。结果1.免疫组化结果显示,在正常宫颈上皮中PDCD4主要定位于基底层和棘层细胞的细胞核中。相对于正常上皮,宫颈上皮内瘤变/原位癌和侵袭性宫颈癌组织中PDCD4表达水平显著下调(p=0.009,p<0.001),相对于宫颈上皮内瘤变/原位癌,侵袭性宫颈癌组织中PDCD4表达水平显著下调(p=0.003)。Western Blot结果显示,相对于癌旁组织,PDCD4在宫颈癌组织中低表达。2.在侵袭性宫颈癌中PDCD4的表达水平与淋巴结转移、组织学类型及p53的表达情况相关(p=0.046,p=0.003,p=0.001)。第二章 PDCD4在宫颈癌细胞系中的功能研究研究目的观察过表达PDCD4对于宫颈癌细胞功能影响。材料与方法1.利用RT-PCR及Western blot技术检测人宫颈癌细胞系Hela、Caski及Siha中的PDCD4的表达情况。选取相对低水平表达PDCD4的Siha细胞,利用慢病毒转染的方法稳定过表达PDCD4。2.利用CCK8、平板克隆形成、细胞周期、细胞凋亡、Transwell迁移、侵袭实验观察过表达PDCD4对Siha细胞生物学功能的影响。结果1.PDCD4在宫颈癌细胞中的表达水平检测与Hela、Caski相比,Siha细胞中PDCD4的表达水平最低,差异有统计学意义。2.PDCD4基因能够促进Siha细胞凋亡,抑制迁移和侵袭(1)分别用Lv-PDCD4和Lv-NC感染Siha细胞,荧光显微镜下观察,感染效率达到90%以上。RT-PCR和Western blot的结果显示,转染了 Lv-PDCD4的细胞PDCD4表达水平显著升高。(2)功能学实验结果显示过表达PDCD4可抑制Siha细胞的迁移和侵袭能力,降低Siha细胞的活力,促进细胞凋亡,但对于细胞的平板克隆形成能力和细胞周期进展并无显著影响。第三章 PDCD4在宫颈癌细胞系中的作用机制研究研究目的探究过表达PDCD4影响宫颈癌细胞功能的分子机制。材料与方法1.siRNA-198靶向沉默Siha细胞中HPV16的e6/e7癌基因,利用RT-PCR及Western Blot的方法检测干扰e6/e7对于PDCD4表达水平的影响。2.PathScan Intracellular Signaling Array Kit 检测分别转染了 Lv-NC 与 Lv-PDCD4的Siha细胞中与疾病密切相关的信号通路关键分子磷酸化水平的变化。结果1.靶向沉默HPV16的e6/e7对于PDCD4的表达水平无显著影响。2.PathScan Intracellular Signaling Array Kit 通路分析结果显示,PDCD4 过表达的Siha细胞中抑癌基因STAT1和p53的磷酸化水平显著上调。结论1.PDCD4在宫颈癌组织中低表达,甚至缺失,且与淋巴结转移、是否为鳞癌及p53的表达情况相关。2.PDCD4促进Siha细胞的凋亡,抑制迁移和侵袭。3.Siha细胞中HPV16的e6/e7对于PDCD4的表达无调控作用。PDCD4调控Siha细胞的生物学功能可能与p53和STAT1的激活相关。