论文部分内容阅读
丝裂霉素C(mitomycin C,MMC)是1956年从放线菌(Streptomyces caespitosus)的培养物中分离出的一种天然抗生素,目前广泛应用于各种癌症的临床治疗,对消化道癌、肺癌、肝癌、乳腺癌等多种肿瘤有良好的疗效。但是,MMC在用于恶性肿瘤治疗时,多通过静脉或动脉注射用药,毒副作用较大。它的毒副作用主要为骨髓抑制,对注射局部刺激可引起动静脉炎,药物外漏后可产生注射部位的硬结和坏死,这些副作用影响MMC在临床中的广泛应用。如何能最大限度地提高药效杀伤肿瘤细胞,而且能把毒副作用减少到最低程度都是MMC肿瘤化疗中的重要问题。蛋白质作为在有机体的生命活动过程具有重要生理功能的生物大分子,是药物的重要载体和靶分子,因此药物分子与蛋白质间的相互作用及作用机理的研究,对于了解药物的作用机制十分重要。人血清白蛋白(Human serum albumin,HSA)是血液循环系统中含量最丰富的载体蛋白,占血浆蛋白总量的60%。它能够同许多内源性、外源性物质结合,在体内起着贮存和运输的作用。因此研究药物与HSA之间的相互作用有助于了解药物在体内的运输和分布情况,对于阐明药物的作用机制、代谢动力学以及毒性等都有重要意义。本课题采用荧光光谱法、紫外光谱法、圆二色光谱法和分子模拟技术,对MMC与HSA间的相互作用进行了系统的研究。荧光光谱研究结果表明因加入MMC导致的HSA内原荧光猝灭的机制是静态猝灭过程,MMC和HSA形成复合物。在不同温度下MMC与HSA之间的结合常数分别为3.35×104 L mol-1(288 K)、2.71×104 L mol-1(298 K)、2.07×104L mol-1(308K)。热力学分析结果表明MMC-HSA结合过程是自发、放热过程。热力学分析及分子模拟研究表明在MMC与HSA的结合中疏水性作用起重要作用。pH及离子强度影响实验结果表明静电作用在MMC-HSA结合中起一定作用。MMC与HSA的Trp214之间的距离为4.55nm。同步荧光光谱和圆二色光谱研究表明MMC的结合并未引起HSA二级结构和Tyr、Trp残基周围微环境的明显改变。分子模拟结果显示MMC位于亚结构域ⅠB和ⅡA之间的疏水性腔内(位点Ⅰ的入口处)。人血红蛋白(HHb)是红细胞中含量最丰富和具有重要的生理功能的一种载体蛋白,不仅具有运输O2和CO2的作用,而且还是能够可逆地结合许多外源性和内源性成分,可以作为药物的天然储库。由于HHb是重要的O2运输蛋白,因此对药物和HHb之间相互作用及药物结合后HHb结构、功能变化的研究有重要意义。紫外和荧光光谱研究结果表明,在MMC-HHb体系,它们之间发生了明显的相互作用,MMC对HHb内原荧光猝灭是形成复合物的静态猝灭过程。在不同温度下MMC与HHb之间的结合常数分别为2.77×104 L mol-1(288 K)、2.56×104 L mol-1(298 K)、2.15×104 L mol-1(308K)。热力学分析结果表明MMC-HHb结合过程是自发、放热过程。热力学分析及分子模拟研究表明表明在MMC与HHb的结合中疏水性作用及氢键起重要作用。同步荧光光谱研究结果表明MMC与HHb结合后,HHb分子Tyr残基周围微环境极性减弱,疏水性增加。圆二色光谱研究表明MMC的结合并未引起HHb二级结构的明显改变。分子模拟结果显示MMC位于HHb的中央空腔α2对β1形成的裂缝中,稍偏于亚基α2。有些化疗药物与热疗联合具有显著的协同作用,热疗与化疗的联合应用(热化疗,thermochemotherapy)成了肿瘤治疗的一个新方式。热疗能够促进药物进入肿瘤细胞、药物与癌细胞DNA的结合,可抑制肿瘤细胞对化疗药物损伤的修复,同时增强药物诱发肿瘤细胞凋亡。本课题以人肝癌细胞株HepG-2作为研究对象,研究了MMC与加热联合应用对HepG-2细胞增殖的影响及其可能的作用机制。MTT实验结果表明,43℃加热1h处理提高了MMC对HepG-2细胞的细胞毒性。MMC联合加热处理诱导HepG-2细胞凋亡率高于单纯药物处理。而且实验表明加热处理能够诱导NQO1酶活性增加。这都是MMC联合加热处理效应可能的机制。环糊精类(Cyclodextrins,CD)是葡萄糖以1,4-糖苷键连结成的环状化合物。按照组成葡萄糖单元数目(6-13个),CD分为多种,其中最常见的是聚合度分别为6,7和8的α-、β-、γ-CD。CD具有一个环外亲水性、环内疏水性且有一定大小的立体手性空腔,能够与不同的化合物形成包合物。羟丙基环糊精(hydroxypropyl-β-CD, HP-CD)可以作为药物辅料提高药物水溶解度及稳定性和降低药物的毒副作用,因而在药物制剂方面的应用正引起广泛关注。本课题利用竞争光谱法来研究了MMC与HP-CD之间的相互作用,并且用经典恒温法、荧光光谱法和MTT法来研究MMC—HP-CD包合物的稳定性及体外抗肿瘤作用。以酚酞作为竞争试剂的竞争光谱法表明酚酞、MMC和HP-CD形成1：1包合物,MMC-HPCD包合常数为611Lmol-1(25℃)、468 Lmol-1(35℃)、279 Lmol-1(45℃)。MMC-HPCD包合的热力学分析结果说明MMC与HP-CD的结合过程是自发进行的放热过程,而范德华力是主要的驱动力。热稳定性实验结果表明MMC-HP-CD包合物的热稳定性比MMC高1倍(MMC的分解速度常数K25=0.00047h-1,在HP-CD存在条件下的分解速度常数K25=0.00024 h-1)。荧光猝灭实验结果表明,HP-CD存在时MMC对HSA内原荧光的猝灭减弱一点(MMC—HP-CD的Stern-Volmer猝灭常数为1.97×104 Lmol-1, MMC的Stern-Volmer猝灭常数为2.12×104Lmol-1)。MTT结果显示,与MMC作用相比,MMC—HP-CD包合物对HepG-2肝癌细胞的生长抑制作用明显增强。